[发明专利]一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法，属于生物技术领域。

背景技术

葡萄座腔菌属（Botryosphaeria. Sp）中苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeria stevensii）、葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）和钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa）是苹果病害中三种重要的病原菌真菌。这三种病原真菌都可危害苹果、梨等果树的枝干和果实，在枝干、果实上形成溃疡、轮纹等症状，是世界上严重影响苹果生产的重要病原菌（Slippers &Wingfield 2004；王璠等 2013）。葡萄座腔菌属（Botryosphaeria. Sp）中苹果壳色单隔孢溃疡病菌（B. stevensii）为我国进境植物检疫性有害生物，寄主范围很广，除了苹果、梨以外，还可危害葡萄、橡树、榆树、枇杷等11个科，18个属的植物（Van Niekerk et al. 2004）。而对于该属病原菌的检测目前主要依靠病原菌的危害症状、菌落特征、病菌的无性型和有性型形态学特征，但是很难将它们进行区分而鉴定到种。

发明内容

为克服现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法，简便快捷、特异性高、通用性好，能快速准确地鉴定出葡萄座腔菌属（Botryosphaeria. Sp）中三种重要的病原菌苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeria stevensii）、葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）和钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa），特别适用于出入境检验检疫对进出口苹果携带的此类病原真菌的快速鉴定。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法，包括以属于葡萄座腔菌属（Botryosphaeria. Sp）的待检菌株DNA为模板，采用引物EF1-S和EF1-A进行PCR扩增的步骤；若扩增产物仅含有230-250bp的DNA片段，则待检菌株为葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）；若扩增产物仅含有140-160bp的DNA片段，则待检菌株为苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeria stevensii）；若扩增产物仅含有170-180bp的DNA片段，则待检菌株为钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa）；所述引物EF1-S和EF1-A的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

在本发明中，所述PCR扩增体系含有2 ×TaqDNA聚合酶缓冲液 12.5μL、引物EF1-S 0.5μL、引物EF1-A 0.5μL、待检菌株DNA 1μL和无菌双蒸水 10.5μL。

在本发明中，所述PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，48℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

在本发明中，以待检菌株的DNA为模板，采用ITS基因片段的通用引物ITS-F和ITS-R鉴别待检菌株是否属于葡萄座腔菌属（Botryosphaeria. Sp），所述引物ITS-F和ITS-R的序列分别如: SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

本发明以我国口岸截获的葡萄座腔菌属真菌为试验材料，将ITS和EF-1α两个基因共同作为葡萄座腔菌属（Botryosphaeria. Sp）中三种重要的病原菌苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeria stevensii）、葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）和钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa）的标准DNA条形码。首先，通过ITS通用引物鉴别病原菌属于葡萄座腔菌属（Botryosphaeria. Sp），然后通过针对EF-1α基因的特异性引物，鉴别病原菌是否为上述三种之一。本发明鉴定方法简便快捷、特异性高、通用性好，能快速准确地鉴定出是否为上述三种病原菌，特别适用于出入境检验检疫对进出口苹果携带的此类病原真菌的快速鉴定。

附图说明