[发明专利]一种新型果糖基肽氧化酶及其应用

说明书

本发明涉及一组果糖基肽氧化酶突变体及其应用。本发明通过对果糖基肽氧化酶的突变体筛选，获得了稳定性明显提高的果糖基肽氧化酶突变体。本发明还涉及了果糖基肽氧化酶在催化果糖基肽化合物氧化脱糖基中的应用，可进一步用于检测糖化血红蛋白的试剂盒或传感器中。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种热稳定性提高的果糖基肽氧化酶及其在美德拉化合物脱糖基反应中的应用。

背景技术

人体内的糖化血红蛋白(HbA1c)是一种美德拉化合物(Amadori化合物)。血液中游离的葡萄糖将红细胞内的血红蛋白β链N端缬氨酸的游离氨基果糖基化，从而产生HbA1c。这个糖基化反应在体内持续、缓慢、不可逆地进行着，它的速度受血糖水平的直接影响。所以人体内HbA1c的浓度可以反映一段较长时间内的血糖水平。这就很好地克服了目前广泛使用的空腹测血糖受短期饮食、作息、药物等因素影响的弊端，因此，国际糖尿病联盟推出的新版亚太糖尿病防治指南中，明确指出糖化血红蛋白测定是国际公认的糖尿病监控“金标准”。

HbA1c水平测定依赖于果糖基肽氧化酶。HbA1c首先被蛋白酶消化成短肽，暴露出末端的果糖基缬氨酸(Fru-Val)或果糖基缬氨酸-组氨酸(Fru-Val-His)，在果糖基肽氧化酶的催化下，通过检测其过氧化物产物，就可以快速对HbA1c浓度进行定量。来自Eupenicillium terrenum ATCC 18547的果糖基肽氧化酶(Fructosylpeptide oxidase E,FPOX-E)(Biochem Biophys Res Commun.2003Nov 7；311(1):104-11)具有理想的底物选择性与较高的催化活性，很适合HbA1c的水平测定；但是，FPOX-E热稳定性较差，40℃保温2小时就有明显沉淀，在检测试剂的储存、运输的条件高，极大地限制了这一检测方法的应用。

因此，亟待获得一种高热稳定性且高活性的新型果糖基肽氧化酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种果糖基肽氧化酶突变体及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种果糖基肽氧化酶突变体，所述果糖基肽氧化酶与SEQ ID NO:2具有至少90％的氨基酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位置的突变，所述突变位点包括SEQ ID NO:2的第30、60、66、95、138、161、171、184、272或388位中的至少一个或者其相应的位置；所述的突变为在所述的突变位点上发生取代、插入或删除一个或多个氨基酸残基。

优选地，所述果糖基肽氧化酶与SEQ ID NO:2具有至少93％的氨基酸序列一致性；更优选地，所述果糖基肽氧化酶与SEQ ID NO:2具有至少95％的氨基酸序列一致性。

优选地，所述的突变为取代突变，至少包含以下一个或多个氨基酸残基的取代：

第30位丝氨酸被精氨酸取代；或

第60位甘氨酸被天冬酰胺或丙氨酸或丝氨酸取代；或

第66位甘氨酸被天冬氨酸取代；或

第95位异亮氨酸被亮氨酸取代；或

第138位丙氨酸被酪氨酸或缬氨酸或异亮氨酸取代；或

第161位丙氨酸被天冬氨酸取代；或

第171位异亮氨酸被精氨酸取代；或

第184位甘氨酸被天冬氨酸取代；或

第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代；或

第388位组氨酸被酪氨酸取代。

更优选地，所述的突变为以上突变的组合，选自：

(1)包含第30位丝氨酸被精氨酸取代和第66位甘氨酸被天冬氨酸取代；或