[发明专利]一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法

说明书

本发明公开了一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，属于基因工程技术领域。本发明方法为通过RNAi降低里氏木霉木聚糖酶基因、纤维素内切酶基因的表达，具体包括如下步骤：将两端有限制性内切酶识别位点且含有SEQ ID NO.1所示序列的干扰片段通过相应限制性内切酶和DNA连接酶构建到pSilent‑1上；将所构建的重组载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉纤维素酶酶活得到提高。本发明通过RNAi干扰序列的合理设计，不仅显著降低木聚糖酶的表达，还适度降低纤维素内切酶的表达、增强葡糖苷酶的表达，优化了纤维素酶酶系中三种酶的活性比例，提高了里氏木霉纤维素酶酶活。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法。

背景技术

里氏木霉纤维素酶是一种广泛应用的酶类，里氏木霉具有胞外表达酶量大等优点，是工业生产酶制剂中广泛应用的菌种。里氏木霉产生的纤维素酶酶系组成中，葡糖苷酶的活力相对较低。已有的提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法是通过基因工程的手段导入纤维素葡糖苷酶基因，提高葡糖苷酶的酶活；或者敲除某一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，从而提高纤维素酶蛋白的分泌量。目前这些方法中，每次只能剔除一个基因或增强一个基因的表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，以及通过该方法得到的里氏木霉菌株。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，为通过RNAi降低里氏木霉木聚糖酶基因、纤维素内切酶基因的表达，提高里氏木霉纤维素酶酶活。

优选的，所述的双基因干扰提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法，包括如下步骤：

（1）将两端有限制性内切酶识别位点且含有SEQ ID NO.1所示序列的干扰片段通过相应限制性内切酶和DNA连接酶构建到pSilent-1上。

（2）将步骤（1）构建的重组载体转化到里氏木霉中，转化有重组载体的里氏木霉纤维素酶酶活得到提高。

步骤（1）中所述的限制性内切酶优选为SnaBI和ApaI。

步骤（2）优选通过农杆菌将所构建的重组载体转化到里氏木霉中。

步骤（2）中所述的里氏木霉优选为里氏木霉ATCC24449。

一种里氏木霉菌株，为上述转化有重组载体的里氏木霉。

本发明具有如下优点和有益效果：本发明通过RNAi干扰序列的合理设计，不仅显著降低木聚糖酶的表达（不表达），而且还适度降低纤维素内切酶的表达、增强葡糖苷酶的表达，优化了纤维素酶酶系中三种酶的活性比例，提高了里氏木霉纤维素酶酶活。木聚糖酶表达的消失也有利于葡糖苷酶表达量的增加和纤维素酶的纯化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1、材料

里氏木霉ATCC24449，质粒pSilent-1（Biovector），农杆菌EHA105，大肠杆菌DH5α，限制性内切酶（TakaRA）等。