[发明专利]一种检测人类CYP2C19基因多态性的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因多态性检测方法，尤其是一种检测人类CYP2C19基因多态性的方法及试剂盒。

背景技术

1.CYP2C19基因简介

细胞色素P450酶系(Cytochome P450，CYP450)是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶家族，是一组含亚铁血红素的酶。主要参与药物I的相关代谢，80％药物代谢与之有关。其中CYP2是最大的家族，有15个亚家族(CYP2A-2Q)，大约20％的临床代谢药物经其代谢，CYP2C19是CYP2家族中最重要的药物代谢酶之一，许多内源性底物，以及临床上大约2％的药物都由其催化代谢。

CYP2C19基因定位于人10号染色体q24.1-q24.3区带上，其全部顺序包含9个外显子，编码490个氨基酸。CYP2C19酶又称为S-美芬妥英羟化酶，现已发现其至少存在14种突变基因，28种等位基因型。其中编码正常酶活性的基因是CYP2C19*1，CYP2C19等位基因主要是*1，*2，*3......*17。而CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因占东方人弱代谢表型(PM)的99％以上。*2，*3等位基因编码的酶无活性，CYP2C19*2等位基因变异的外显子5第681位处的碱基发生变异(G/A)形成了一个异常剪接点，使得CYP2C19酶丧失了催化活性，由此导致的慢代谢在中国人中的发生率约为30％。CYP2C19*3等位基因是在外显子4第636位发生G/A突变，产生了提前的终止密码，蛋白合成终止，使CYP2C19酶活性丧失。

研究表明，CYP2C19*2和CYP2C19*3两种突变可解释99％的东方人弱代谢者及88％的白种人弱代谢者的表型。经CYP2C19代谢的药物主要包括以下几类：质子泵抑制剂、抗癫痫、镇静药及抗抑郁药、抗凝药等。因此当CYP2C19成为以上药物的主要代谢酶时，不用基因型个体的药动学参数将受到不同的影响。一般情况，快代谢型代谢药物比较快。不易产生不良反应，而慢代谢型代谢药物缓慢，容易导致不良反应的产生。因此对于快代谢患者应适量的加大药量以达到有效血药浓度，而对于慢代谢患者来说应适当的减少药量以防止药物的不良反应。

因此，需要通过检测CYP2C19基因多态性对相关药物血药浓度的影响合理调整药物的剂量，从而使临床上相关药物的应用真正走向个体化，以提高临床疗效，减少不良反应。

2.CYP2C19基因多态性检测方法简介

目前对于检测SNP突变检测的方法很多，主要运用的方法包括：直接测序法、ARMS-PCR法、酶切(PCR-RLFR)法、DNA芯片法、TaqMan-MGB探针分型法等。

这些方法在推广上都或多或少存在如试剂检测成本高，操作复杂，易产生污染，产生一定假阴性和假阳性等缺陷。

如：1)直接测序法，该检测方法需要对欲检测片段进行PCR扩增，然后用DNA测序仪测序，是SNP检测的金标准。纯合型SNP位点的测序峰为单一峰型，而杂合型SNP位点的测序峰为套峰，因而很容易将其区分开来。缺点是反应过程需要开盖处理产物，容易造成气溶胶污染，且整个反应流程耗时，并不经济。

2)ARMS-PCR法，等位基因特异性扩增法，也称扩增阻碍突变系统，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行PCR，只有突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物，由于错配位于引物的3`端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。该方法通过采用PCR反应结束后进行电泳，从有无放映条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了PCR污染的机会，而且耗时费力。

3)酶切(PCR-RLFR)法，利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一经过PCR扩增富集的DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。但该技术应用限制性因素是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点，且方法也较为繁琐。