[发明专利]一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法

权利要求书

1.一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a、制备氧化葡聚糖包被的四氧化三铁包被抗原和免疫原；

b、制备抗氧化葡聚糖包被的四氧化三铁抗体，所述抗体的效价达到1:64000；

c、将氧化葡聚糖包被的四氧化三铁包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中，封闭、加入不同浓度的氧化葡聚糖包被的四氧化三铁标准液，以抗氧化葡聚糖包被的四氧化三铁抗体作为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体作为二抗，进行间接竞争酶联免疫分析法；

d、以氧化葡聚糖包被的四氧化三铁标准液浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标建立标准曲线，从而定量检测出氧化葡聚糖包被的四氧化三铁的浓度；

所述氧化葡聚糖包被的四氧化三铁的制备方法包括以下步骤：

取0.5 g M_w=40000葡聚糖40溶解在10 mL去离子水中，然后加入7.5mL 0.4 g NaIO₄水溶液，在80℃搅拌30分钟，移除加热器加入5 mL的乙二醇阻止葡聚糖进一步氧化，最后用NaOH溶液调节pH为7；

1 mmol FeCl₃▪6H₂O和2 mmol Fe(NH₄)₂(SO₄)₂▪6H₂O混合溶解在10 mL去离子水中，然后与氧化葡聚糖溶液混合，快速加入5 mL 0.6 g NaOH溶液大力搅拌10分钟，转移到聚四氟乙烯内衬的高压釜中，160℃水热处理10 h，最后冷却到室温离心或磁分离收集，即可得到氧化葡聚糖包被的四氧化三铁；

所述步骤a具体包括以下步骤：

a-1、氧化葡聚糖包被的四氧化三铁50 μL溶于4 mL PBS溶液中或100 μL溶于3 mL PBS溶液中，然后加入0.1 mL浓度为1~10 mg/mL的羟基琥珀酰亚胺溶液和0.2mL浓度为1~10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液，震荡15~30 min，加入0.2mL 1%牛血清白蛋白溶液，25℃反应2~4 h，将所得溶液装入透析袋中，用蒸馏水4℃透析12 h收集，即得到氧化葡聚糖包被的四氧化三铁免疫原；

a-2、氧化葡聚糖包被的四氧化三铁 50 μL溶于4 mL PBS溶液中或100 μL溶于3 mLPBS溶液中，然后加入0.1 mL浓度为1~10 mg/mL的羟基琥珀酰亚胺溶液和0.2mL浓度为1~10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液，震荡15~30 min，加入0.2mL 1%鸡卵清白蛋白溶液，25℃反应2~4 h，将所得溶液装入透析袋中，用蒸馏水4℃透析12 h收集，即得到氧化葡聚糖包被的四氧化三铁包被抗原；

所述氧化葡聚糖包被的四氧化三铁中含有的Fe₃O₄量为80 mM；

所述羟基琥珀酰亚胺溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液、牛血清白蛋白溶液、鸡卵清白蛋白溶液均为相应的PBS溶液；

所述步骤b具体包括以下步骤：

b-1、首次免疫：将氧化葡聚糖包被的四氧化三铁免疫原与福氏完全佐剂等体积比混合后，背部皮下多点注射到动物体内，注射8~10个点，注射量为1~2mL /只；首次免疫三周后进行加强免疫；

b-2、加强免疫：将氧化葡聚糖包被的四氧化三铁免疫原与福氏不完全佐剂等体积比混合后，采取同样的方式注射到动物体内，注射量为1mL/只；此后每隔两周再进行一次加强免疫，期间采血测效价，直到抗体效价达到1:64000，进行最后一次加强免疫，从动物颈动脉采血，取血清部分制得氧化葡聚糖包被的四氧化三铁抗体；

所述步骤c具体包括以下步骤：

c-1、包被：用包被缓冲液将氧化葡聚糖包被的四氧化三铁包被抗原溶液稀释200倍加入96孔酶标板中，100 μL/孔，4℃过夜；

c-2、封闭：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3min，然后加入1wt%酪蛋白封闭，每孔200µL，37℃温育1~2h；

c-3、加样竞争：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3min，然后将50µL 不同浓度的氧化葡聚糖包被的四氧化三铁标准液和50µL抗氧化葡聚糖包被的四氧化三铁抗体分梯度加入各孔中，37℃温育1.5~2h；

c-4、加酶：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3~5min，然后每孔加入100µLPBS稀释的稀释比为1/5000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，37℃温育2~4h；

c-5：显色: PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3~5min，然后每孔加入100µL邻苯二胺底物液进行显色反应，37℃显色30min；

c-6、终止：每孔加入50µL 2mol/L的H₂SO₄终止反应，在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的线性方程为A=1.17651-0.07137lgC，其中A为490nm处吸光度值，C为氧化葡聚糖包被的四氧化三铁浓度。