[发明专利]一种基于单分子的检测过氧化氢的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用单分子荧光显微术检测过氧化氢含量的方法。本发明属于生物传感检测领域。

背景技术

区别于传统的光学成像，单分子检测技术的出现将成像方式推新至新的阶段：揭示隐藏在整体平均水平下分子的不均一性和其独特的动态过程。利用单分子荧光显微术，能够发现分子间的差异及分子与其所处微纳环境的相互作用，并且通过对单个分子的实时追踪，可以得到单个分子实时的动态变化。基于此方法，多种酶分子与无机纳米催化剂的催化特性被解析（Science 1998，Nature Materials 2008等）。同时单分子荧光检测方法具有极佳的信噪比、检测灵敏度及极高的时间分辨率，因而也被应用至核酸检测方面（Nature Communication 2015）。

过氧化氢（H₂O₂）在调控细胞内许多重要的生理进，在生命系统、宿主防御以及细胞信号转导起着的双重作用，因而在最近的报道中被称为是“必须的恶魔”。由于H₂O₂的重要功能，滴定，荧光测定，电化学方法等方法被用于开发新的H₂O₂检测的策略。其中，电化学方法具有直接并且实时的检测的优点，然而，传统的电化学传感方法很难提供细胞内的空间信息及成像信息。一些对H₂O₂非常敏感的荧光分子也被用来作为细胞内或细胞外检测的探针。但是这些荧光发色团很容易被漂白，因此很难在生理环境中对H₂O₂含量的动态变化进行长时间观测。因此目前迫切需要一种灵敏、成像清晰、实时的检测方法。

发明内容

本发明针对现有检测方案灵敏度、信噪比、成像方面存在的问题，提出利用利用单分子荧光显微术结合核酶（DNAzyme）开发一种灵敏的检测过氧化氢的方法。该方法可对检测过程进行实时成像追踪，并可捕获单个产物生成过程。

在本发明的技术方案中，采用核酶G-四联体（G-quadruplex）固定在玻片上，追踪其催化Amplex Red生成荧光产物试卤灵的反应进行信号采集。

本发明的方法具体为：

一种基于单分子的检测过氧化氢的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）核酶结构的生成

将一定比例的G-四联体DNA与Cy 5、生物素双修饰的固定链混合均匀，于95℃孵育10 min，缓慢降温，使G-四联体与固定链杂交并形成四联体结构，得到复合物Ⅰ；

（2）核酶在玻片上固定

稀释复合物Ⅰ至一定浓度后，与血晶素（hemin）以一定比例于25℃孵育一段时间，得到复合物Ⅱ；将复合物Ⅱ与链霉亲和素修饰的玻片孵育一定时间后，缓冲液冲洗干净过量复合物；

（3）利用单分子荧光显微镜追踪监测过程

在玻片上滴加100微升反应液，反应液包括一定浓度的过氧化氢及Amplex Red；采用单分子荧光显微镜实时观测复合物Ⅱ催化无荧光Amplex Red 生成荧光产物试卤灵（resorufin）的过程。

所采用的缓冲液为本领域常规缓冲溶液，优选的缓冲溶为含有pH=7.4、100 mM K Cl、10 mM 磷酸盐缓冲液。

所采用的G-四联体DNA为本领域常规的G-四联体DNA序列，优选的为DNA序列表中序列；所采用的G-四联体DNA与固定链的比例可以为本领域常规的比例，优选的比例为1:1。

所采用的稀释复合物Ⅰ浓度至10^-11-10^-9 M，优选的浓度为5×10^-11 M；所采用的复合物Ⅰ与血晶素孵育比例可以为本领域常规的比例，优选的比例为2:1。

所采用的复合物Ⅰ与血晶素孵育时间可以为本领域常规的时间，优选的时间为20 min。

所采用的链霉亲和素修饰的盖玻片步骤参考2008年5月29日发表在Nature Methods第5期第6卷第507-516页的题为A practical guide to single-molecule FRET的论文Supporting Online Information中的S6所记载的修饰方法；所采用的复合物Ⅱ与链霉亲和素修饰的盖玻片的孵育时间可以为本领域常规的时间，优选的时间为10 min。