[发明专利]一种基于单分子的检测过氧化氢的方法

权利要求书

1.一种基于单分子的检测过氧化氢的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）核酶结构的生成

将一定比例的G-四联体DNA与Cy 5、生物素双修饰的固定链混合均匀，于95℃孵育10 min，缓慢降温，使G-四联体与固定链杂交并形成四联体结构，得到复合物Ⅰ；

（2）核酶在玻片上固定

稀释复合物Ⅰ至一定浓度后，与血晶素（hemin）以一定比例于25℃孵育一段时间，得到复合物Ⅱ；将复合物Ⅱ与链霉亲和素修饰的玻片孵育一定时间后，缓冲液冲洗干净过量复合物；

（3）利用单分子荧光显微镜追踪监测过程

在玻片上滴加100微升反应液，反应液包括一定浓度的过氧化氢及Amplex Red；采用单分子荧光显微镜实时观测复合物Ⅱ催化无荧光Amplex Red 生成荧光产物试卤灵（resorufin）的过程。

2.根据权利要求1的一种基于单分子的检测过氧化氢的方法，其特征在于，所采用的缓冲液为本领域常规缓冲溶液，优选的缓冲溶为含有pH=7.4、100 mM K Cl、10 mM 磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1的一种基于单分子的检测过氧化氢的方法，其特征在于，所采用的G-四联体DNA为本领域常规的G-四联体DNA序列，优选的为DNA序列表中序列；所采用的G-四联体DNA与固定链的比例可以为本领域常规的比例，优选的比例为1:1。

4.根据权利要求1的一种基于单分子的检测过氧化氢的方法，其特征在于， 所采用的稀释复合物Ⅰ浓度至10^-11-10^-9 M，优选的浓度为5×10^-11 M；所采用的复合物Ⅰ与血晶素孵育比例可以为本领域常规的比例，优选的比例为2:1。

5.根据权利要求1的一种基于单分子的检测过氧化氢的方法，其特征在于， 所采用的复合物Ⅰ与血晶素孵育时间可以为本领域常规的时间，优选的时间为20 min。

6.根据权利要求1的一种基于单分子的检测过氧化氢的方法，其特征在于，所采用的复合物Ⅱ与链霉亲和素修饰的盖玻片的孵育时间可以为本领域常规的时间，优选的时间为10 min。

7.根据权利要求1的一种基于单分子的检测过氧化氢的方法，其特征在于所采用的所采用的单分子荧光显微镜为本领域常规显微镜，优选的为全内反射荧光显微镜，所述的单分子荧光显微镜成像参数可以为本领域常规的参数，较佳的647、561 nm激光控制在5 %左右，较佳的曝光时间控制在30-50 ms；所述的单分子荧光显微镜成像条件可以为本领域常规的条件，较佳的成像温度控制在20 ℃左右，所述成像的湿度控制在50 %以下。

8.根据权利要求1的一种基于单分子的检测过氧化氢的方法，其特征在于所采用的Amplex Red 浓度范围控制在100-200 nM，优选的浓度为100 nM。

9.根据权利要求1的一种基于单分子的检测过氧化氢的方法，其特征在于数据采集时，首先利用Cy 5荧光分子确定复合物Ⅱ的位置，而生产的荧光产物在561 nm激光激发，当二者可以共定位时，采集荧光产物随时间变化的曲线。

10.根据权利要求1的一种基于单分子的检测过氧化氢的方法，其特征在于，最低可检测到100 pM的H₂O₂。