[发明专利]一种定位木本植物花粉管蛋白的免疫荧光方法及其试剂盒

说明书

本发明提供一种定位木本植物花粉管蛋白的免疫荧光方法及其试剂盒。所述试剂盒中包括固定液、酶解液、封闭液、一抗和二抗；所述固定液中含有PEPES、蔗糖、TritonX‑100、多聚甲醛、NaCl、KCl、Na₂HPO₄和KH₂PO₄，所述酶解液中含有纤维素酶、离析酶、NaCl、KCl、Na₂HPO₄和KH₂PO₄，所述封闭液中含有牛血清白蛋白、NaCl、KCl、Na₂HPO₄和KH₂PO₄，所述一抗为目的蛋白抗体，所述二抗为FITC标记的山羊抗兔二抗。本发明以苹果花粉管为试材，通过酶解花粉管壁后，进行免疫荧光标记。采用本发明的方法可以直接、高效、灵敏、特异性的定位花粉管中的功能蛋白，为直观鉴定木本植物花粉管内功能蛋白的表达及定位提供技术体系。

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地说，涉及一种定位木本植物花粉管蛋白的免疫荧光方法及其试剂盒。

背景技术

木本植物由于生长周期长、遗传转化困难，因此对于功能基因的研究存在较多技术限制。目前，鉴定木本植物内源蛋白表达、定位的方法主要是将目的蛋白融合荧光蛋白转入模式植物体内，通过对荧光蛋白的观察间接鉴定目的蛋白的表达及定位等性质。但又因其遗传背景不同，导致证据不够充分，无法直观的鉴定体内功能蛋白的性质。

随着医学及动物学领域中免疫荧光技术的发展，为植物学研究中直观鉴定蛋白的表达及定位提供了技术基础。然而，植物细胞具有细胞壁这一特点，使得在研究过程中首先要进行组织切片方可进行免疫标记。因此，对于花粉管等无法进行切片的组织则受到很多技术限制。在拟南芥花粉管的研究中，通过酶解花粉管壁后在进行免疫标记可以特异性的观察花粉管内功能蛋白的表达及定位。而木本植物的花粉管壁的组分与拟南芥不尽相同，因此对于木本植物花粉管的研究更为困难。房克凤等(电子显微镜学报，2015)利用免疫荧光标记技术鉴定了苹果花粉管壁的组分，但对于木本植物花粉管内功能蛋白的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一套用于定位木本植物花粉管蛋白的试剂组合及其试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种定位木本植物花粉管蛋白的免疫荧光方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一套用于定位木本植物花粉管蛋白的试剂组合，包括固定液、酶解液、封闭液、一抗和二抗；所述固定液中含有PEPES、蔗糖、TritonX-100、多聚甲醛、NaCl、KCl、Na₂HPO₄和KH₂PO₄，所述酶解液中含有纤维素酶、离析酶、NaCl、KCl、Na₂HPO₄和KH₂PO₄，所述封闭液中含有牛血清白蛋白、NaCl、KCl、Na₂HPO₄和KH₂PO₄，所述一抗为目的蛋白抗体，所述二抗为FITC标记的山羊抗兔二抗。其中所述目的蛋白是指花粉管蛋白。

本发明所述一抗的制备方法如下：

(1)小摇培养，分别将构建在pEASY载体上的带有目的片段的质粒转化BL21(DE3)PlySs菌液按1:100比例接种至相应抗性培养基中，37℃，200rpm过夜培养。

(2)大摇培养，将小摇菌液按1:100比例接种于1L相应抗性培养基中，37℃，200rpm摇菌至OD₆₀₀＝0.6，加入0.2M IPTG 2ml，16℃185rpm过夜诱导。

(3)收集菌液，8000rpm，4℃，离心5min。

(4)将收集的沉淀重悬于PBS缓冲液中，涡旋震荡均匀。