[发明专利]一种黄曲霉毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种黄曲霉毒素的适配体亲和柱及其制备方法和用途。该亲和纯化柱利用黄曲霉毒素B1的核酸适配体，修饰后通过共价键连接固相载体上。再用此载体填料装柱，制备成适配体亲和柱。该亲和柱具有特异性强，黄曲霉毒素纯化效率高和使用简便的特点。

背景技术

黄曲霉毒素（aflatoxin ，AFT）主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物。在世界不同地区都发现了这些真菌大量存在于供人类食用的食品中，黄曲霉毒素污染已导致严重的食品安全问题。黄曲霉毒素是一类毒性极强的物质，具有强致癌性和强免疫抑制性。1993年AFT被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为I类致癌物。黄曲霉毒素广泛的分布于发霉的粮食及其制品中，特别是花生、花生油、玉米及其制品、乳及乳制品，发霉的饲料中也有发现含有较多的黄曲霉毒素。迄今为止，已经发现的黄曲霉毒素至少包含黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2等17种结构相似且特征已知的化合物。其中黄曲霉毒素B1是（AFTB1）是自然发生潜力最大、最为常见的一种毒素。是黄曲霉毒素中的主要成份。其毒性和致癌性也最强。

世界各国和地区均制定了严格的AFT限量标准，且限量要求日益严格。

目前黄曲霉毒素的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）、放射免疫分析法、微柱法等。

其中薄层层析法是最早使用也是最广泛使用的检测黄曲霉毒素的方法，但是薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需时间较多，容易受到杂质的干扰。比较适合黄曲霉毒素的定性检测。

放射免疫分析法由于使用到放射性元素，容易造成放射性污染，目前已经很少人使用。酶联免疫分析法操作简便，使用较为安全。但由于酶本身不稳定，用此方法检测有可能带来一定的假阳性和假阴性的问题。微柱法主要用于快速筛选出超标样本，很难对毒素进行种类区分和定量检验。仅仅适用于定性检测。

高效液相色谱法在操作上较为简便，可同时检测多个黄曲霉毒素种类，适于大批量的样品分析。但是高效液相色谱检测收到前期样本处理的限制，只有前期将样本进行纯化才能得到更好的检测结果。而免疫亲和纯化柱很好的解决了这一问题。利用免疫亲和纯化柱和高效液相色谱联用能快速、准确的得到结果，并且灵敏度很高。目前已经被国家标准GB/T18979-2003采用。

免疫亲和柱具有操作简单，特异性高的优点。但是由于抗体获得困难，免疫亲和柱通常比较昂贵。并且由于抗体本身是一种蛋白质，其活性受到周围环境的影响。保存不当或者操作不当很容易造成抗体失活从而影响免疫亲和柱的效率。

适配体是一段核酸序列，通常为DNA或者RNA序列。 单链的核酸序列可以形成二级结构，从而能与靶点特异性结合。通过多次的富集和筛选，能够筛选到与靶点有高亲和力的特异性适配体。Herman等描述了核酸适配体的结合特异性，[Science 287,820-825].核酸适配体相对于抗体来说更稳定，不易受到环境的影响，并且核酸适配体可以化学合成，保证序列的准确性。[Song. Trends Analy. Chem 2008.27(2)]。

核酸适配体被应用于小分子的检测，在专利CN105505940A中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体DNA传感器。通过黄曲霉毒素B1的适配体，及多条互补探针序列制备DNA传感器，通过酶底物反应，实现黄曲霉毒素B1的检测。在专利CN105400790A中，描述了一种黄曲霉毒素的检测方法。利用黄曲霉毒素B1的适配体与蔗糖酶结合，通过酶与糖底物的相互作用，依靠血糖仪实现黄曲霉毒素B1的检测。上述都是利用黄曲霉毒素适配体实现毒素的检测。

在毒素分离中，专利CN 104651369A中描述了一种黄曲霉毒素磁性分离方法，将黄曲霉毒素B1核酸适配体序列与磁珠结合，实现分离。在专利CN104399283中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体亲和柱。该专利利用环氧基活化的琼脂糖微球，将黄曲霉毒素B1的适配体偶联，制备成亲和柱。实现黄曲霉毒素的分离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄曲霉毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途

在本发明中，我们利用SELEX系统，从适配体文库中筛选出来一条高特异性、高亲和力的的新的黄曲霉毒素B1的DNA适配体。适配体修饰后与N-羟基琥珀酰亚胺活化的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到黄曲霉毒素B1的特异性载体。载体装柱后就形成了高亲和力的黄曲霉毒素毒素B1适配体亲和柱