[发明专利]一种高效重组表达限制性内切酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别是一种高效重组表达限制性内切酶的方法。

背景技术

限制性内切酶是当代基因工程研究不可缺少的一类重要工具酶，是现代分子生物学的基础。自20世纪60年代末第一个限制性内切酶被发现之后，越来越多的限制性内切酶被发现、提纯并获得应用。

现有技术中生产限制性内切酶的方法主要是将限制-修饰基因克隆入质粒，使用与限制性内切酶对应的特异性甲基化酶制备限制性内切酶，靠质粒的高拷贝数实现目的蛋白高表达，这种方法的制备程序繁琐、限制性内切酶得率低、生产成本高，获得的甲基化保护的菌株只能特异性保护宿主DNA免于某一种限制性内切酶的切割，应用范围狭窄。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提出了一种操作简便、成本低、酶活力好的高效重组表达限制性内切酶的方法。

本发明要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的，一种高效重组表达限制性内切酶的方法，其特点是，包括如下步骤：

（1）先将限制性内切酶基因插入，再将载体转化导入大肠杆菌，筛选培养、测序，获得限制性内切酶的重组表达质粒；

所述质粒载体为利用乳糖操纵子和T7启动子调控，IPTG诱导的pET系列表达载体；

（2）将限制性内切酶的重组表达质粒转化至BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，筛选获得限制性内切酶的重组表达菌株；

（3）扩大培养限制性内切酶的重组表达菌株并诱导表达限制性内切酶。

本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的方法中，所述的限制性内切酶选自：BclI，DpnI，DpnII，EcoRI，HindIII，KpnI，MluI，MseI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，NspV，PstI，SalI， SbfI，SgeI，SspI，StuI，TaqI，XbaI，XhoI。

本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的方法的步骤（1）中，所述的质粒载体为pET-28b。

本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的方法的步骤（1）中，将限制性内切酶基因片段连接至质粒载体上后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，再涂布于含葡萄糖和卡那霉素的LB平板上筛选克隆，测序获得限制性内切酶的重组表达质粒。进一步优选地，所述的葡萄糖的浓度为0.5-2g/100mL，卡那霉素的浓度为37.5-150μg/mL。进一步优选地，所述的葡萄糖的浓度为1-1.5g/100mL，卡那霉素的浓度为50-120μg/mL。

本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的方法的步骤（2）中，将限制性内切酶的重组表达质粒转化至BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，涂布于含葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的LB平板上筛选培养，获得限制性内切酶的重组表达菌株。进一步优选地，所述的葡萄糖的浓度为0.5-2g/100mL，卡那霉素的浓度为37.5-150μg/mL，氯霉素的浓度为17.5-70μg/mL。进一步优选地，所述的葡萄糖的浓度为1-1.5g/100mL，卡那霉素的浓度为50-120μg/mL，氯霉素的浓度为20-50μg/mL。

本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的方法的步骤（3）中，将限制性内切酶的重组表达菌株划线培养并挑取单菌落接种于含葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的LB培养液中，振荡培养过夜，将得到的培养物接种于葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的LB培养液中，摇动培养一段时间，加入IPTG诱导表达限制性内切酶。