[发明专利]一种高效重组表达限制性内切酶的方法

权利要求书

1.一种高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）先将限制性内切酶基因插入，再将载体转化导入大肠杆菌，筛选培养、测序，获得限制性内切酶的重组表达质粒；

所述质粒载体为利用乳糖操纵子和T7启动子调控，IPTG诱导的pET系列表达载体；

（2）将限制性内切酶的重组表达质粒转化至BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，筛选获得限制性内切酶的重组表达菌株；

（3）扩大培养限制性内切酶的重组表达菌株并诱导表达限制性内切酶。

2.根据权利要求1所述的高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于，所述的限制性内切酶选自：BclI，DpnI，DpnII，EcoRI，HindIII，KpnI，MluI，MseI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，NspV，PstI，SalI， SbfI，SgeI，SspI，StuI，TaqI，XbaI，XhoI。

3.根据权利要求1所述的高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述的质粒载体为pET-28b。

4.根据权利要求1所述的高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于，在步骤（1）中，将限制性内切酶基因片段连接至质粒载体上后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，再涂布于含葡萄糖和卡那霉素的LB平板上筛选克隆，测序获得限制性内切酶的重组表达质粒。

5.根据权利要求4所述的高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于，所述的葡萄糖的浓度为0.5-2g/100mL，卡那霉素的浓度为37.5-150μg/mL。

6.根据权利要求1所述的高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于，在步骤（2）中，将限制性内切酶的重组表达质粒转化至BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，涂布于含葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的LB平板上筛选培养，获得限制性内切酶的重组表达菌株。

7.根据权利要求6所述的高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于，所述的葡萄糖的浓度为0.5-2g/100mL，卡那霉素的浓度为37.5-150μg/mL，氯霉素的浓度为17.5-70μg/mL。

8.根据权利要求1所述的高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于，在步骤（3）中，将限制性内切酶的重组表达菌株划线培养并挑取单菌落接种于含葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的LB培养液中，振荡培养过夜，将得到的培养物接种于葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的LB培养液中，摇动培养一段时间，加入IPTG诱导表达限制性内切酶。

9.根据权利要求8所述的高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于，在步骤（3）中，将限制性内切酶的重组表达菌株划线培养并挑取单菌落接种于含0.5-2g/100mL葡萄糖、37.5-150 μg/mL卡那霉素和17.5-70 μg/mL氯霉素的LB培养液中，振荡培养过夜，将得到的培养物按接种量2-5%接种于含0.5-2g/100mL葡萄糖、37.5-150 μg/mL卡那霉素和17.5-70 μg/mL氯霉素的LB培养液中，于35-37℃摇动培养，至菌密度达到3×10⁸-4×10⁸/mL时，加入IPTG至终浓度为0.2-0.5mM，并在15-18℃下以200-250 rpm摇动培养12-18 h，诱导表达限制性内切酶。