[发明专利]一种慢病毒载体、重组慢病毒质粒、病毒及病毒的应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种慢病毒载体、重组慢病毒质粒、病毒及病毒的应用。

背景技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)作为一种合成跨膜蛋白，以单链可变区(single chain variable fragment，scFv)取代TCR的a、G链可变区，并与T细胞信号传导区域CD3ζ连接，当scFv识别肿瘤细胞表面特异性抗原，直接将信号向细胞内传导，使T细胞活化并分泌细胞因子，杀伤肿瘤细胞[1]。此外，额外的胞内细胞传导信号结构域也被加入进来，例如CD28与4-1BB，由此也被分别称为2代和3代CARs[1]。CAR-T细胞免疫疗法也正是近几年被改良使用到临床上的新型细胞疗法，在急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，ALL)[2]和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)[3,4]的治疗上有着显著的疗效，被认为是目前最有前景的肿瘤治疗方式之一。

大多数的CAR都以肿瘤相关性抗原作为靶点，现阶段常用的靶点除CD19以外[2,3]，也有相关报道以ERRB2(HER-2)治疗胶质瘤[5]和骨肉瘤[6]。尽管尚不详尽，但它清晰的表明CAR-T细胞在抗肿瘤方面的广泛应用前景。然而，CAR-T细胞免疫疗法仍面临着诸多实际困难，最显著的是CAR-T细胞回输患者体内引起的强烈免疫反应，亦称“细胞因子风暴”。同样，CAR-T策略的治疗作用仍然存在诸多问题，主要归纳为以下几点：1)肿瘤微环境对CAR-T细胞的抑制效应，以氧化应激，缺氧以及酸性pH值为主要特征；2)肿瘤源的可溶性免疫抑制因子或细胞因子，譬如TGF-β、IL-10以及可溶性的PD-L1对CAR-T细胞的拮抗作用；3)免疫抑制性的免疫细胞对CAR-T细胞的抑制作用，例如调节性T细胞(T_regs)，骨髓源的抑制性细胞(MDSC)，肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)或者肿瘤相关性的中性粒细胞(TAN)；4)T细胞固有的负调节机制以及抑制性分子的过度表达，譬如易受肿瘤微环境诱导表达的PD-1分子，被肿瘤细胞表面配体PD-L1识别结合，导致T细胞功能受损而丧失向免疫系统发出攻击肿瘤细胞的信号；5)CAR-T细胞自身毒性和免疫原性也是亟待解决的问题。

PD-1是一种重要的细胞免疫抑制分子，以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义[7]。目前，免疫抑制PD-1和PD-L1已在多种实体肿瘤治疗中取得较显著的效果，包括肺癌[8]、胃癌[9]、卵巢癌[10,11]等。有研究表明，anti-Her2CAR刺激的T细胞能够显著增强CD8⁺T细胞表面的PD-1的表达，同时伴随着乳腺癌细胞表面PD-L1的表达增多，抑制CAR-T细胞介导杀伤肿瘤细胞的信号，然而当免疫抑制PD-1或PD-L1后，能够显著增强CAR-T细胞清除肿瘤细胞的功能[12,13]。目前全球已批准临床使用的PD-1抗体为Opdivo和Keytruda，根据多项临床研究数据表明，这两个PD-1抗体单用在不同的肿瘤适应症中有效率为20％左右，且3级/4级药物相关的不良反应发生率高，并观察到药物相关肺毒性引起死亡的病例[14,15]。

鉴于此，若能将CD19嵌合体抗原受体与针对PD-1的发卡RNA干扰基因同时整合到细胞的基因组上，并使其发挥相应的生物功能，将有望提高免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。