[发明专利]一种慢病毒载体、重组慢病毒质粒、病毒及病毒的应用

权利要求书

1.一种改造后的慢病毒载体pGreenPuro-Dual，该载体全序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体pGreenPuro-Dual，其特征在于，在pGreenPuro shRNA质粒基础上，于CMV启动子下游插入EF1a启动子，用于调控筛选基因copGFP-Puro的表达；于CMV启动子下游设计插入的限制性内切酶位点Xba I、Age I、Nhe I以及Xho I可用于外源目的基因的插入；还包含H1启动子，用于调控插入的shRNA的转录。

3.一种重组慢病毒质粒，该质粒为在如权利要求1或2所述慢病毒载体pGreenPuro-Dual的XbaI和XhoI位点之间插入包含人CD8前导肽、鼠CD19单链抗体轻链可变区、柔性连接肽、鼠CD19单链抗体重链可变区、人CD8α绞链区、人CD28跨膜区以及人CD3ζ信号传导区；同时，在H1启动子下游BamHI和EcoRI位点之间插入含有针对人PD-1的shRNA序列。

4.根据权利要求3所述的重组慢病毒质粒，其特征在于，所述重组慢病毒质粒pGreenPuro-Dual/CD19-CAR/shRNA1PD-1或者pGreenPuro-Dual/CD19-CAR/shRNA2PD-1；所述的shRNA序列为shRNA1或shRNA2，其中shRNA1F：GATCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCTTCCTGTCAGACTCTCTTTGATCTGCGCCTTGTTTTTTG、shRNA1R：AATTCAAAAAACAAGGCGCAGATCAAAGAGAGTCTGACAGGAAGCTCTCTTTGATCTGCGCCTTGG；shRNA2F：GATCCGCCTAGAGAAGTTTCAGGGAACTTCCTGTCAGATTCCCTGAAACTTCTCTAGGCTTTTTG、shRNA2R：AATTCAAAAAGCCTAGAGAAGTTTCAGGGAATCTGACAGGAAGTTCCCTGAAACTTCTCTAGGCG。

5.根据权利要求4所述的重组慢病毒质粒，其特征在于，所述质粒中CD19-CAR编码的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2所示；其中人CD8抗原前导肽编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-21位氨基酸所示；抗鼠CD19单链抗体的轻链可变区编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第22-128位氨基酸所示；抗鼠CD19单链抗体的重链可变区编码的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第144-263位氨基酸所示；人CD8α铰链区编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第264-310位氨基酸所示；人CD28跨膜区编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第311-337位氨基酸所示；人CD28胞内区编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第338-378位氨基酸所示；和人CD3ζ胞内区编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第379-489位氨基酸所示。

6.根据权利要求4所述的重组慢病毒质粒，其特征在于，所述质粒中CD19-CAR编码的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3所示；其中抗CD19单链抗体的编码CD8前导肽的序列如SEQ ID NO:3第1-63位核苷酸序列所示；抗鼠CD19单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:3第64-384位核苷酸序列所示；抗鼠CD19单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:3第430-789位核苷酸序列所示；人CD8α铰链区的编码序列如SEQ ID NO:3第790-930位核苷酸序列所示；人CD28跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:3第931-1010位核苷酸序列所示；人CD28胞内区的编码序列如SEQ ID NO:3第1011-1134位核苷酸序列所示；和人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:3第1135-1467位核苷酸序列所示。

7.一种重组慢病毒，其特征在于，是采用权利要求3-6中任一所述的重组慢病毒质粒与慢病毒辅助包装质粒共转染宿主细胞后得到的包装体。

8.根据权利要求7所述的重组慢病毒，其特征在于，所述慢病毒辅助包装质粒为pCMV.dR8和pMD2.G质粒。

9.权利要求7-8任一所述的重组慢病毒感染的T细胞在制备治疗CD19介导的疾病的药物中的应用；所述CD19介导的疾病包括白血病和淋巴瘤。

10.根据权利要求9所述的重组慢病毒感染的T细胞在制备治疗CD19介导的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述CD19介导的疾病包括B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病和急性髓性白血病。