[发明专利]一种RHDV重组聚合酶等温扩增检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物检测技术，具体涉及一种检测兔出血症病毒(RHDV)的特异性引物和重组聚合酶等温扩增检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

兔出血症是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一种高度接触性、急性、致死性传染病，常呈暴发性流行，对家兔饲养行业造成毁灭性的损失。RHDV的基因组为一条单股正链的RNA分子，由约7437个核苷酸组成，基因组含有2个开放阅读框架，衣壳蛋白VP60是主要的结构蛋白。RHDV的常用检测方法有血凝试验(HA)、反向间接血凝(IHA)、免疫扩散法、荧光抗体法、酶联免疫吸附法(ELISA)、电镜观察法、RT-PCR法等。HA、IHA、免疫扩散法等方便快捷，但敏感性较低,不适宜于微量病毒的检测。ELISA、荧光抗体法较为成熟，但不及RT-PCR方法敏感。常规RT-PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，需要特殊的基因扩增仪器。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。英国公司TwistDx Inc以此为基础开发的核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。RPA反应的最适温度在37℃～42℃，无需变性，在常温下即可进行，这无疑能大大加快基因扩增的速度。此外，由于不需要特殊的温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种检测兔出血症病毒(RHDV)的特异性引物，以及重组聚合酶等温扩增检测方法，该方法具有简便、快速、敏感性高、特异性好等优势，完全能够满足快速检测RHDV的需要。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测兔出血症病毒(RHDV)的特异性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列为：

上游引物F：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA-3’；如SEQ.ID.NO.1所示；

下游引物R：5’–CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgTT-3’；如SEQ.ID.NO.2所示。

所述引物所对应的特异性扩增片段位于RHDV参照基因(Genbank DQ205345)的第5301-5617位点之间，大小为317bp，其核苷酸序列为：

5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAACCCATTCACAgCCg-3’，如SEQ.ID.NO.4所示。

一种兔出血症病毒(RHDV)重组聚合酶等温扩增检测方法，为：提取肝脏组织的RNA，利用上述特异性引物进行重组酶聚合酶等温扩增，并检测扩增产物，若能扩增出317bp的条带，则判断为RHDV阳性，反之则为阴性。

优选的，所述提取肝脏组织的RNA的具体方法如下：