[发明专利]一种RHDV重组聚合酶等温扩增检测方法

权利要求书

1.一种检测兔出血症病毒的特异性引物，其特征在于：包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列为：

上游引物F：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA-3’；如SEQ.ID.NO.1所示；

下游引物R：5’–CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgTT-3’；如SEQ.ID.NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的检测兔出血症病毒的特异性引物，其特征在于：所述引物所对应的特异性扩增片段位于RHDV参照基因的第5301-5617位点之间，大小为317bp，其核苷酸序列为：

5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAACCCATTCACAgCCg-3’，如SEQ.ID.NO.4所示。

3.权利要求1或2所述的检测兔出血症病毒的特异性引物在检测兔出血症病毒中的应用。

4.一种兔出血症病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，其特征在于：提取肝脏组织的RNA，利用权利要求1所述的特异性引物进行重组酶聚合酶等温扩增，并检测扩增产物，若能扩增出317bp的条带，则判断为RHDV阳性，反之则为阴性。

5.根据权利要求4所述的兔出血症病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，其特征在于：所述提取肝脏组织的RNA的具体方法如下：

将肝脏组织用PBS以1∶10研磨成悬液,装入EP管中，于-80℃反复冻融3次，冻融后以9000×g离心10min，取上清液300μL于离心管中，加入900μL TRIZOL试剂，剧烈颠倒6～10次，室温静置10min；加入200μL氯仿，上下颠倒60～100次，室温静置5min；4℃10000×g离心10min；取上清移入离心管中，加等体积的异丙醇，轻轻摇匀，-20℃放置30min，4℃10000×g离心10min，倒掉上清；加入1mL 75％乙醇溶液，4℃10000×g离心5min，去掉上清，干燥5min，用0.1％DEPC水溶液溶解RNA，-20℃冻存。

6.根据权利要求4所述的兔出血症病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，其特征在于：进行重组酶聚合酶等温扩增时，按照TwistAmp DNA Amplification Kits试剂盒操作说明进行，反应体系为：20μmol/μL的上、下游引物各1.2μL，RT Buffer 29.5μL，Template 10μL，ddH2O 5.6μL；漩涡混匀，离心；加入2.5μL 280mM MgAc，混匀。

7.根据权利要求4所述的兔出血症病毒重组聚合酶等温扩增检测方法，其特征在于：进行重组酶聚合酶等温扩增时，扩增参数为：40℃15min后取出，冷却至室温；混匀后，离心，40℃35min。