[发明专利]建立乳腺癌易感基因突变动物模型的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种建立乳腺癌易感基因突变动物模型的方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

目前国内外对遗传性多态位点的研究多局限于疾病表型和基因多态性之间相关性。缺乏进一步阐述基因多态性改变的功能学意义的深入研究。

我们开展临床病例-对照研究发现，针对HR通路中DNA双链损伤修复重要基因CHEK2突变进行研究。

而且对于医学研究来讲，培育出与病症相应的动物模型是加快研究进度，提高研究效果的必然路径。然而由于培育技术的局限性，想要建立一种恰当的动物模型，仍然需要大量的探索。

发明内容

本发明的目的在于提供一种建立乳腺癌易感基因突变动物模型的方法及应用，为研究乳腺癌易感基因突变提供平台。

目前我们的研究组在早发性乳腺癌人群中发现了新的错义突变CHEK2 Y390C(390位的酪氨酸突变为半胱氨酸)，该突变携带者在150名早发性乳腺癌人群中的明显比例高于正常年轻女性，提示该突变和早发性乳腺癌的遗传易感性有关。迄今未见其他关于CHEK2 Y390C的报道。我们推断CHEK2 Y390C突变可能成为中国早发性乳腺癌特有的多 态性位点。在体外细胞学研究中我们证实该突变为无功能突变，表达突变的细胞影响DNA损伤后的细胞周期和凋亡。基于此，我们提出假设：CHEK2 Y390C突变可能通过影响乳腺癌细胞周期的改变，进而导致染色体的不稳定性发生。因此，通过建立的CHEK2 Y390C基因敲入小鼠模型，以研究该突变功能验证阶段，通过该模型的建立，我们力图阐明等位基因CHEK2 Y390C与乳腺癌遗传易感性的关系，为CHEK2基因与乳腺癌遗传易感性之间的关系奠定基础。

本发明采用了如下技术方案：

一种建立乳腺癌易感基因突变动物模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，构建与人CHEK2 Y390C相对应的位点的相应动物的打靶载体，

步骤二，通过电转，将打靶载体转入ES细胞中；

步骤三，筛选正确同源重组的ES克隆，

步骤四，将ES进行囊胚注射，得到嵌合体动物，再经过繁育和纯化后获得可稳定遗传的Y390C动物模型。

进一步，本发明的建立乳腺癌易感基因突变动物模型的方法，还可以具有这样的特征：步骤一中，与人CHEK2 Y390C对应的小鼠位点为Y394C。

进一步，本发明的建立乳腺癌易感基因突变动物模型的方法，还可以具有这样的特征：步骤二中，ES细胞为B6/BLU ES细胞系。

进一步，本发明的建立乳腺癌易感基因突变动物模型的方法，还可 以具有这样的特征：通过长片段PCR及Southern blot筛选出中靶克隆。

进一步，本发明的建立乳腺癌易感基因突变动物模型的方法，还可以具有这样的特征：其中，所述长片段PCR的5’端引物是：

CHEK2-5F2:GAGGTCTGTTTCTTACCTGC

ES-1R3:AAGGGTTATTGAATATGATCGGA

所述长片段PCR的3’端引物是：

CHEK2-3R1:TCTGAAGAGATGAATGTGTG

ES-2F4:GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG

进一步，本发明的建立乳腺癌易感基因突变动物模型的方法，还可以具有这样的特征：步骤四中，囊胚注射后首先选取高嵌合率的嵌合体小鼠。

进一步，本发明的建立乳腺癌易感基因突变动物模型的方法，还可以具有这样的特征：步骤四中，将嵌合体小鼠与B6小鼠进行繁育，得到的F1代小鼠用PCR测序鉴定基因型。

进一步，本发明的建立乳腺癌易感基因突变动物模型的方法，还可以具有这样的特征：其特征在于：将KIn的杂合小鼠与全身表达Cre的品系交配，去除Neo得到KI模型；将KI/wt小鼠互配得到纯合子小鼠。

本发明还提供上述的纯合子小鼠在筛选乳腺癌药物中的应用。

发明的有益效果

本发明的建立乳腺癌易感基因突变动物模型的方法，由于在小鼠中引入与人CHEK2 Y390C突变对应的Y394C，因此能够建立一种对CHEK2 Y390C的功能进行研究的模型动物，为乳腺癌易感基因的研究提供便利。

附图说明

图1是打靶载体的图谱；

图2是打靶载体的XhoI单酶切验证结果；

图3是ApaLI单酶切验证结果；

图4是5’长片段PCR筛选结果图之一；