[发明专利]一种细胞培养用SFL微载体及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种细胞培养用SFL微载体的制备方法，包括以下步骤：（1）蚕茧脱胶；（2）配制纯丝素蛋白溶液；（3）采用W/O/O复乳法制备微球；（4）交联固化成球；（5）除油洗涤；（6）还原脱色；（7）洗涤。本发明还提供应用该方法制备得到的细胞培养用SFL微载体及其应用。本发明原料无毒性，采取W/O/O复乳法乳化成球，一定温度下交联固化，无需再次偶联修饰，得到的微载体表面呈多孔，比表面积大、生物相容性好、适合多种细胞培养使用。整个制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，生物安全性高，易于工业化生产，本发明的微载体能够在搅拌状态下悬浮培养，适合于多种贴壁细胞大规模悬浮培养，具有广阔的市场前景。

技术领域

本发明涉及一种细胞培养用SFL微载体及其制备方法和应用。

背景技术

微载体培养技术是研究动物细胞的结构、功能和分化、以及生产许多重要的生物制品如疫苗、酶类、激素、抗体、干扰素和核酸等所必需的技术。

目前，动物细胞大规模化培养的主要方式为微载体贴壁培养技术和全悬浮培养技术。但全悬浮培养技术尚不成熟，仅限于少数细胞系能实现。而大多数贴壁依赖型动物细胞都可用微载体进行培养。动物细胞的微载体培养技术能把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼具两者的优点，放大容易，培养基利用率较高，培养条件（温度、pH值、CO₂浓度等）易控制，能起到保护细胞抵抗物理和化学压力的作用，且培养过程可实现系统化、自动化，减少劳动力需求，不易被污染。因此，微载体培养技术是当前动物细胞大规模培养的发展趋势。

自1967年Van Wezel第一个用DEAE-Sephadex A50作为贴壁细胞培养用微载体以来，研究报道的细胞培养用微载体已有十多种，包括葡聚糖微载体、聚赖氨酸液体微载体、大孔明胶微载体、纤维素微载体、壳聚糖微载体、甲壳素微载体、聚苯乙烯微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。国外商品化的微载体主要有：如GE公司的Cytodex 1、Cytodex 2、Cytodex 3和Cytopore、Cytoline、Biosilon、Cultispher G等，但这些进口产品价格昂贵，目前市场价已达4-10万元/kg(以Cytodex系列为例)，还出现供不应求的现象，国内的市场几乎已被国外公司垄断。

国内对细胞培养用微载体的研究起步较晚，生产规模较小，难以工业化生产，目前尚无商品化的微载体面世，远不能满足我国生物制药领域疫苗、重组药物蛋白、单克隆抗体、细胞因子及其受体等医用生物制品生产的需要，所有生物疫苗企业都是用进口产品，并且外国公司的产品每年都在涨价。造成此现象的原因很多，如技术难度大，技术和研发人员分散，所需资金投入大，研发周期长等。

目前，在发达国家，生物制药行业贴壁依赖型动物细胞培养工艺已普遍采用生物反应器微载体培养工艺，几千升、上万升的动物细胞培养生物反应器已用于抗体或人用及兽用疫苗的生产，微载体细胞培养的规模已达到6000L以上。而我国绝大多数疫苗类制药行业仍然沿用传统的转瓶（滚瓶）培养工艺，该工艺劳动强度大，细胞产量低，产品批间差异大，容易造成污染，耗时耗力，导致我国绝大多数生物制药企业的产品生产成本高，产值低，无法与国外产品竞争。要提高产品竞争力，只有采用自主研发的生物反应器微载体大规模培养技术。

微载体原料首选要求：①无毒性；②优良的生物相容性和可生物降解；③天然的高聚物；④价格低廉。

丝素蛋白为天然材料，来源广泛，非哺乳动物源性，生物相容性优良，含有丰富的起细胞粘附作用的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸三肽序列，能支持多种细胞的黏附、增殖和分化。以其为原料制备微载体是当前的研究热点，且目前尚无商品化的丝素蛋白微载体。

我国是产丝大国，家蚕蚕茧和年生丝量分别为68万吨和817万吨，占全世界总产量的70%；柞蚕的总产量占全世界的90%左右。我国蚕丝行业产量区域集中度非常高，据2013年统计数据显示，蚕丝产量主要集中在华东、华南、西南地区，产量分别占同期全国总产量的39.2%、27.1%、26.1%。