[发明专利]一种细胞培养用SFL微载体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种细胞培养用SFL微载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）蚕茧脱胶：将蚕茧在Na₂CO₃溶液中进行脱胶，获得丝素蛋白纤维，再用去离子水洗净丝素蛋白纤维并自然晾干；

（2）配制纯丝素蛋白溶液：将步骤（1）得到的丝素蛋白纤维溶于三元溶液或其他溶液中，在75℃下搅拌溶解，离心过滤后，取滤液进行透析，得到纯丝素蛋白溶液，作为水相；所述三元溶液为CaCl₂/H₂O/CH₃CH₂OH；所述其他溶液为LiBr，CaCl₂，Ca（NO₃）₂或H₃PO₄；

（3）采用W/O/O复乳法制备微球：在搅拌状态下，将步骤（2）获得的水相缓慢加入油相1乳化一定时间，形成W/O混合相，然后再将W/O混合相加入到油相2再乳化一定时间，形成均一稳定的W/O/O混合相，制备得到丝素蛋白微球；

所述油相1选自真空泵油、机油、大豆油、花生油、菜籽油、异辛烷、正己烷、环己烷、二氯甲烷、Span80和Tween-80中的一种或几种混合；

所述油相2选自液体石蜡、乙酸乙酯、乙酸丁酯、环己烷、汽油、硅油、玉米油、大豆油、Span80和Tween-80中的一种或几种混合；

所述水相：油相1：油相2的体积比为1：1-20:1-20；搅拌转速为200-1000rpm；

（4）交联固化成球：向步骤（3）得到的W/O/O混合相中缓慢加入交联剂进行交联，获得微球；

所述交联剂为EDC/NHS、京尼平、环氧硅烷、马来酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、戊二醛、聚乙二醇缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、氮丙啶中的一种或几种混合；

（5）除油洗涤：停止搅拌，静置，除去上层的油乳液，先后用表面活性剂和去离子水反复洗涤步骤（4）获得的微球，抽滤得到丝素蛋白微球；

所述表面活性剂为聚氧乙烯壬基酚醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸单酯、石油醚、OP-10、SA-2两性表面活性剂、Tween-20、Tween-60中的一种或几种混合；

所述表面活性剂溶液的质量百分浓度为0.1-10%；

（6）还原脱色：用还原剂中和多余的交联剂；所述还原剂为硼还原剂或甘氨酸；

（7）洗涤：去除还原剂溶液，再用去离子水反复洗涤丝素蛋白微球，至上清液呈中性为止，洗涤后筛分选择粒径为100-400μm的微载体，得到细胞培养用SFL微载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述蚕茧来源于天然家蚕、柞蚕或天蚕的一个或任意两个的组合；所述Na₂CO₃溶液的质量浓度为0.01%-5%；所述蚕茧与Na₂CO₃溶液的质量体积百分比为1%-20%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述丝素蛋白纤维与三元溶液或其他溶液的质量体积百分比为1%-30%；所述纯丝素蛋白溶液的质量浓度为1-30%；

所述透析是先用自来水进行透析1-2天，再用去离子水进行透析1-2天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述交联剂用量为W/O/O混合相总体积的1%-20%；所述交联时，搅拌转速为50-1000rpm，交联温度为4-60℃，交联时间为1-20小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（6）中，采用2%的硼还原剂还原脱色2-8h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（7）中，洗涤后筛分选择粒径为200-300μm的微载体。

7.细胞培养用SFL微载体，其特征在于：是用权利要求1所述方法制备得到的。

8.权利要求7所述的细胞培养用SFL微载体在贴壁依赖型细胞培养中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述细胞为BHK-21细胞、Vero细胞、MDCK细胞、CHO-K1细胞和Marc-145细胞。