[发明专利]增强鲁米诺体系的电化学发光生物传感器的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于增强鲁米诺体系电化学发光信号，构建用于检测miRNA生物传感器的新方法，属于生物传感器制备领域。该方法可应用于miRNA临床诊断以及对miRNA的定量分析。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是一类含有19—23个碱基的非编码单链小分子RNA，广泛存在于人体和几乎所有模式生物的细胞中，这些小分子RNA通过碱基配对与信使RNA(mRNA)序列的3′UTR区或编码区结合从而调控靶基因的表达，在动植物的发育、细胞生长分化和凋亡、代谢等生命活动过程中发挥重要的调控作用。最近有研究结果表明，miRNA的异常表达与多数癌症相关，如胰腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌和卵巢癌等。这些miRNA所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能。因此，对细胞或组织样本中miRNA的定量检测将有利于人们进一步了解miRNA的表达与癌症发生之间的关系。miRNA也有望被用作有价值的标志物，用于早期的癌症诊断和预后，这对与探索生物进化及防治人类疾病具有重要意义。

由于miRNA序列短、在细胞内的表达水平比较低，而且许多同源miRNA(如let-7家族)序列相似度高，仅差1—2个碱基，使设计的分析探针与miRNA杂交的效率低。所以，miRNA的研究给分析化学在检测的灵敏度和选择性方面都提出了新的挑战。当前，miRNA的检测方法主要有Northern印迹、微阵列芯片、聚合酶链式反应(PCR)扩增和原位杂交,但是因为操作繁琐、耗时长、灵敏度低等缺点这些传统方法在应用上受到限制。近年来，为了提高miRNA检测的灵敏度，多种DNA扩增技术如恒温滚环扩增技术等相继被应用于miRNA分析；为了提高miRNA的检测通量，相继开发了多种探针标记技术以及检测新方法。

本实验中采用的检测信号是电化学发光(ECL)信号。ECL是在电极上施加一定的电压使电极反应产物之间或电极反应产物与溶液中某组分进行电化学反应而产生的一种光辐射。它包括了电化学分析和化学发光分析两个进程，因此既保留了化学发光方法灵敏度高、线性范围宽、观察方便和仪器简单等优点；同时增加了许多化学发光方法无法比拟的优点,如重现性好、试剂稳定、控制容易，从而引起人们的注意并得到了广泛的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于增强鲁米诺体系ECL信号，用于miRNA检测的生物传感器制备方法。此方法从电化学发光的反应机理出发，利用血红素作为辣根过氧化物类似物，可有效催化过氧化氢的分解的特性，在本质上实现了鲁米诺体系电化学发光信号的增强，从而更灵敏地检测目标miRNA。该方法灵敏度高、特异性强、检测成本低。

本发明采取如下技术方案：

1.增强鲁米诺体系的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征

在于，包括以下步骤：

1)确定待检测的目标miRNA，设计与其碱基互补的DNA探针序列；

2)玻碳电极的预处理：打磨玻碳电极，超声清洗，氮气吹干后将电极浸入5mM氯金酸溶液中，通过循环伏安法，初始电压和低电位设置为0V，高电位为1V，在此区间内循环扫描电沉积金纳米颗粒；

3)将DNA探针溶液滴加在电极表面，室温下于湿盒中自组装16-20h，带有巯基修饰的探针通过Au-S键固定到金纳米颗粒表面；

4)滴加葡萄糖氧化酶封闭电极表面非特异性活性位点，于4℃下培育3h；

5)将目标miRNA滴加到电极表面，室温下杂交30min，形成miRNA-DNA双链结构；

6)将血红素溶液滴加到杂交后的电极表面，室温下培育1h。

2.进一步，设计的DNA探针自身不会杂交。

3.进一步，所用玻碳电极的直径是3mm，打磨粉为0.05μm Al₂O₃粉末。

4.进一步，电沉积过程中的扫速为50mV/s，扫描圈数为5圈。

5.进一步，滴加的DNA探针溶液由PBS缓冲液配置，浓度为25μM，体积为10μL；PBS缓冲液浓度为5mM，PBS的pH＝7.4，

6.进一步，滴加的葡萄糖氧化酶浓度为0.5mg/mL，体积为10μL。

7.进一步，滴加的血红素溶液浓度为10μM，体积为10μL。

优选的是，设计的DNA探针自身不会杂交缠绕，不会形成发卡或者其他结构，相关检测干扰达到最低。

优选的是，DNA的储备液是由PBS缓冲液配置，浓度为5mM，pH＝7.4。