[发明专利]用于生物分子的基于质谱的表征的方法

说明书

本发明揭示离子‑离子反应化学方法的应用，其中使用质子转移反应PTR与较高碰撞能量解离HCD组合以：(1)简化引入到质谱仪中的样本的复杂混合物分析，以及(2)通过移除电荷、减小碰撞横截面并且在若干情况中增强所获得的序列覆盖度来改进用于超过50kDa的大蛋白质的分析的分辨率和敏感度。

技术领域

本发明涉及质谱法，并且更确切地说涉及用于通过从蛋白质、多肽和其它生物相关多电荷物质产生的质子转移反应产物离子的质谱法来纯化和分析蛋白质或多肽的复杂混合物的方法以及将这些方法应用于获得用于生物物质的识别和定量所必需的基于序列的信息。

背景技术

在最近二十年，质谱法已经在分析从多种不同样本类型导出的蛋白质样本方面取得了极大进展。结合电喷射电离和各种分离技术，可识别和定量单一样本中的数千蛋白质。当今实验室中使用的最常见的方法涉及某一形式的蛋白质提取，继之以所关注的蛋白质样本的蛋白水解分解。类似于胰蛋白酶的蛋白水解酶的使用产生可容易地由多种不同仪器配置分析的肽。被称为“从下到上”蛋白质组研究的此方法可用于研究活细胞依据其环境的状态。“从下到上”方法的主要优点之一是所产生的肽具有极其类似的生理化学性质，这有助于复杂样本中数千肽的直截了当的分离。结合串连质谱法的任何分离方法可随后用于产生用以识别给定样本中的蛋白质的氨基酸序列信息。尽管此技术是许多实验室中的例程，但当将完整蛋白质还原到其组成肽时存在关于可获得的信息的量的限制。

与“从下到上”蛋白质组研究相比，“从上到下”蛋白质组研究指代其中将蛋白质样本完整地引入到质谱仪而无需酶、化学品或其它分解方式的分析方法。从上到下的分析实现完整蛋白质的研究，从而允许直接在蛋白质层级的识别、主要结构确定以及转译后修饰(PTM)的局部化。从上到下的蛋白质组分析通常包括将完整蛋白质引入到质谱仪的电离源中，使蛋白质离子断裂，且测量如此产生的各种片段的质荷比和丰度。所得分段比肽分段复杂得多，这在无本文教示的方法存在下可能必须要使用具有极高质量准确性和分辨率能力的质谱仪以便以可接受的确定性解译分段图案。所述解译一般包含将观测的分段图案与包含从已知样本产生的经编译实验分段结果的蛋白质序列数据库进行比较，或替代地与理论上预测分段图案进行比较。举例来说，Liu等人(《经由四极/飞行时间串连质谱仪中的离子阱碰撞引起的解离和离子/离子反应对先验未知蛋白质的从上到下的蛋白质识别/表征(Top-Down Protein Identification/Characterization of a Priori UnknownProteins via Ion Trap Collision-Induced Dissociation and Ion/Ion Reactions ina Quadrupole/Time-of-Flight Tandem Mass Spectrometer)》，《分析化学(Anal.Chem.)》，2009，81，1433-1441)已经描述对具有多达≈28kDa的质量的经改质和未改质的未知蛋白质的从上到下的蛋白质识别和表征。

从上到下的分析优于从下到上的分析的优点在于可直接识别蛋白质，而不是如从下到上的分析中肽的情况那样进行推断。另一优点在于可以识别蛋白质的替代形式，例如转译后修饰和拼接变体。然而，从上到下的分析当与从下到上的分析相比时具有的缺点在于许多蛋白质会难以隔离和纯化。因此，不完全分离混合物中的每一蛋白质可在质谱分析后即刻产生多个离子物质，每一物质对应于不同相应质子化程度和不同相应电荷态，且每一此类离子物质可带来多个同位素变体。