[发明专利]一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法，具体地说，涉及一种利用胎盘绒毛膜来源间充质干细胞制备低免疫原性组织工程皮肤的方法。

背景技术

皮肤移植，是指将自体健康部位皮肤、异体皮肤或者异种皮肤通过外科手术的方法移植至受损部位，从而快速有效地封闭受损创面，使患者避免减少脱水感染等的发生。目前临床上皮肤移植的主要方法有三种即自体皮肤移植、异种或同种异体皮肤移植以及人工合成皮肤代用品的移植。自体皮肤移植具有不发生免疫排斥反应的优点，但对于烧烫伤患者尤其是大面积烧烫伤患者来说，其来源往往绝对不足，且术后供皮部位可能存在不能自行愈合、感染或瘢痕形成风险，因此其应用受到一定的限制；异种或同种异体皮肤移植具有数量充足、来源相对广泛等优势，但皮肤移植后都会发生强烈的免疫排斥反应，移植皮肤都会很快被排异掉，因此起到覆盖创面的时间相对较短，满足不了烧烫伤患者整个治疗恢复的时间窗，因此此皮肤移植同样受到一定程度的限制；人工合成皮肤材料具有已商品化购买容易、不会发生免疫排斥等的优势也受到人们的关注，但其价格高昂，一般普通经济条件的家庭难以支付如此高额的医疗费用，应用同样受到一定的限制。鉴于以上三种移植方法的比较，降低异体或异种移植皮肤的免疫原性、延长移植皮肤的存活时间可能是比较行之有效的方法，但如何降低移植物的免疫原性是目前挽救大面积、重度烧烫伤患者生命亟待解决的问题。

组织工程皮肤构建的三要素为种子细胞、支架材料和组织构建。

组织工程表皮的种子细胞来源皮肤表皮结构基底层的表皮干细胞、黑色素细胞等，表皮干细胞在一定的微环境下可被诱导向角化细胞分化。其中，表皮干细胞具有强大的增殖和分化潜能，是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键源泉，且在体外培养时更容易保持表皮细胞表型。

支架材料是种子细胞黏附、生长、迁移、增殖和分化的载体，是组织工程皮肤的“真皮”部分。人工合成类支架材料降解速率和微结构容易在合成过程控制，因此容易大规模生产，但其最大缺点是缺乏细胞识别信号，不利于细胞黏附及特异基因激活。天然生物类材料来源的的组织工程产品支架具有良好的相容性和适宜的降解速度，但其缺点是力学能力差。目前多采用胶原、氨基多糖等，该类材料具有良好的力学性能、低免疫原性及天然胶原三维支架结构，是一种理想的组织工程支架材料。

组织构建是组织工程的关键技术，在一定的微环境下，将培养的种子细胞与支架材料复合进行组织构建是组织工程表皮产品的关键步骤。体外构建的组织工程皮肤产品在功能上要接近生理皮肤，表皮细胞必须具有含角化的多层细胞结构，才能保证皮肤移植后具有抗感染、抗摩擦、保湿等防护功能。表皮细胞以单纯的浸没式培养只能形成多层结构，不能正常角化。而采用气-液分离培养的方式进行体外培养，类同于模拟人体在体条件，能够有效构建组织工程皮肤。

间充质干细胞具有抑制异体移植器官免疫排斥，降低移植物抗宿主疾病等的作用，这使其在器官移植领域越来越多的受到人们的关注。胎盘来源间充质干细胞是间充质干细胞家族成员之一，研究表明，胎盘间充质干细胞是免疫原性最低的干细胞之一，其除了具有低免疫原性以及抑制器官移植免疫排斥等间充质干细胞共性外，还具有来源丰富，分离纯化简单不存在伦理道德问题且不会对供体造成损害的优势而备受关注。Pieternella S等已证实，可从人胎盘组织的绒毛膜和基蜕膜中分离得到胎儿侧来源胎盘间充质干细胞(fetal Placental Mesenchymal Stem Cells,fPMSC)和母体侧来源胎盘间充质干细胞(maternal Placental Mesenchymal Stem Cells,mPMSC)。

发明内容

本发明的目的在于解决现有异体来源表皮干细胞构建组织工程皮肤模型在移植耐受过程中发生免疫排斥缺点，提供一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法，该方法采用人类胎儿来源的胎盘间充质干细胞和表皮干细胞作为种子细胞，以牛I型胶原3D基质作为支架，使用气液界面分离法复合构建一种有活性的低免疫原性的全层组织工程皮肤。

其具体技术方案为：

一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法，包括以下步骤：

步骤1、胎儿来源的胎盘间充质干细胞的分离培养