[发明专利]一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法

权利要求书

1.一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、胎儿来源的胎盘间充质干细胞的分离培养

取新鲜胎盘组织，剪取部分胎儿侧胎盘组织，利用PBS漂洗胎盘组织3～5遍直至清洗液无色为止，利用眼科剪彻底剪碎组织，PBS重复洗液3遍，A型胶原酶和DNase Ⅰ酶，37℃水浴消化，消化2小时，洗涤离心接种于10cm无菌培养皿中，置于37℃、5％CO₂条件下培养，第二天小心换液，以后每隔两天换液一次，此细胞即为P₀代，显微镜下观察细胞生长状态，待细胞达70％～80％融合密度时，利用Tryple消化后按1：3传代，继续培养至P₃代作为实验用细胞；

步骤2、表皮干细胞的分离和培养

取同种皮肤组织小块，含双抗的PBS反复冲洗，置Dispase Ⅱ中浸泡过夜，冷消化分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，胰酶热消化，分离表皮干细胞，过滤并接种于I型牛胶原包被的培养皿中，通过专用选择培养基筛选表皮干细胞；

步骤3、复合胎儿来源的胎盘间充质干细胞的I型牛胶原3D支架制备

胶原配置：5-8mL 1.5mg/mL I型牛胶原溶液，0.4mL-1.2mL 10×DMEM，0.2mL-0.6mL NaHCO3，0.6mL-1.2mL 200mM Hepes，PH值在7.3-7.7，配制在低温下进行；将培养好的胎盘间充质干细胞，消化后，以6×10⁶密度重悬于1mL的matrigel中，并与配好的胶原充分混合，配制好后接种到24mm的transwell表面，1.0mL每孔，37℃条件下凝固30min，待胶原成固体后，缓慢添加含MMPs抑制剂marimastat 3nM-6nM的间充质干细胞培养基置于培养箱中过夜；

步骤4、接种表皮干细胞

次日，吸弃培养板中平衡溶液待用，获取培养至70％～80％融和状态的P2代角质形成细胞，以Transwell培养小室作为气液分离支架，支架上，接种1×10⁶细胞数量于24mm的嵌套培养皿的上室中，更换含MMPs抑制剂marimastat 3nM-6nM的表皮干细胞培养基，上室中添加培养基Cnt-07,CELLnTEC 2ml，下室中添加培养基Cnt-07,CELLnTEC 3ml继续培养16h待细胞100％汇合成片；

步骤5、气液分离培养构建组织工程皮肤

更换添加MMPs抑制剂marimastat 3nM-6nM，角质细胞分化培养基Cnt-3D,CELLnTEC继续培养2天，接种后第5天，将24mm的嵌套培养皿上室中液体吸出，保持细胞表面干燥，下室添加角质细胞分化培养基Cnt-3D,CELLnTEC 0.6mL-1.2mL，液面不高于表皮细胞层，每天换液，至12天角化表皮结构形成，即完成组织工程皮肤的制备过程。

2.根据权利要求1所述的低免疫原性组织工程皮肤构建方法，其特征在于，步骤2中的培养基添加Cnt-07,CELLnTEC。

3.根据权利要求1所述的低免疫原性组织工程皮肤构建方法，其特征在于，所述的胎盘间充质干细胞源自健康孕妇生产娩出胎盘的胎儿侧绒毛膜层。