[发明专利]犬科动物间充质干细胞库及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种干细胞库及其构建方法，具体地说是涉及一种犬科动物胎盘、脐带间充质干细胞库及其构建方法。

技术背景：

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞的一种类型，具备干细胞的两个重要特征：很强的自我增殖能力和多分化潜能。还可以从脂肪组织，胎肝，脐血和动员的外周血，胎肺，胎盘，脐带，牙髓，滑膜，牙周膜，子宫内膜，小梁骨和密质骨等多种组织器官分离和培养MSCs。

大量的研究已经表明在合适的培养的条件下，MSCs能分化为中胚层、内胚层和甚至是外胚层细胞，MSCs能分泌多种生长因子和免疫保护因子，其中有些免疫因子在细胞和器官移植过程中广泛应用，最重要的是，MSCs不能形成肿瘤，对组织再生和修复治疗应用是安全的。由于分离纯化相当容易、可以大量培养扩增和多胚层分化潜能，MSCs可以作为干细胞治疗和基因载体理想的细胞来源。MSCs的另一个独特的特点是他们能够逃避免疫识别和抑制免疫反应，因此，MSCs在免疫性疾病的免疫调节细胞治疗过程中将会是一种非常有应用前景的细胞药物。目前，大量动物模型，特别是犬科动物模型的研究已经证明，间充质干细胞可以治疗天疱疮、退行性关节炎、髋关节发育不良、大面积皮肤损伤、皮肤溃疡、角膜溃疡、肝功能衰竭、肾功能衰竭、神经损伤等疾病。MSCs是存在于多种成体组织(如骨髓和脂肪组织等)和围产期胎儿附件组织(如脐带血和脐带组织及胎盘组织等)，具有多向分化潜力，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有多种细胞生物学特性：包括向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)和非间充质系列细胞(外胚层和内胚层来源的组织细胞)分化的潜能，造血支持活性和免疫调节活性，并具有独特的细胞因子分泌功能。是一种潜在的可用于治疗多种疑难疾病的治疗手段。

目前人间充质干细胞的分离扩增及细胞库建立已经十分成熟，且间充质干细胞在人类医学领域的应用已经开展多年，取得了显著的效果，使得干细胞治疗成为了传统治疗手段之外临床医生的新选择。与此类似，间充质干细胞在动物医学领域同样有着巨大的需求和广阔的应用空间，急需一种高效分离动物，特别是犬科动物间充质干细胞的方法，并建立满足临床使用及质量检测需求的规模化标准化制备的犬科动物间充质干细胞库。此外本发明选用脐带胎盘作为分离间充质干细胞的来源组织，有效的利用了动物生产的废弃物，同时不同于骨髓和脂肪干细胞，避免了获取干细胞的过程给供体动物所带来的创伤和痛苦，可以更好的保护动物权益，避免伦理争议。本发明具体的说明了建立犬科动物脐带、胎盘间充质干细胞库的技术方法。并确定了犬科动物间充质干细胞库建立过程中所需的病原学检测，遗传学信息的采集和保存。

通过酶消化和组织贴壁法分离间充质干细胞，容易混入其他的贴壁细胞，比如巨噬细胞和内皮细胞，只有通过多次传代来去除难消化的巨噬细胞和对培养基有不同要求的内皮细胞，这个方法耗时费力并且对技术要求高。本发明利用不同细胞的粒径不同，通过逐级过筛的方法来剔除混杂的巨噬细胞和内皮细胞，无需培养就能得到纯度高的间充质干细胞，与传统的反复贴壁去除杂细胞方法相比，省时省力，并且减少了操作风险。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种高效的犬科动物胎盘、脐带间充质干细胞库的构建方法。

本发明的第二个目的是提供一种犬科动物间充质干细胞库，其可以应用于对犬科动物的免疫性疾病、肝损伤、慢性肾炎的治疗。

根据本发明的一方面，以健康犬科动物的胎盘和脐带为材料来源，提取间充质干细胞，有效的利用了动物生产的废弃物，在不引起伦理争议的前提下构建间充质干细胞库。

根据本发明的另一方面，对构建间充质干细胞库的工艺过程进行优化；

筛选对比多种酶消化法后，发现用体积比为1:1的I型胶原酶(浓度0.5％)和(胰酶浓度0.5％)混合液消化，消化效果良好，远远优于使用单纯酶消化。

多次重复对材料组织的消化和过滤操作，发现重复3-5次，目的细胞得率达到很高水平，再继续重复则收获不大。

根据本发明的再一方面，针对上述方法的改进，设计了一种细胞过滤器，其具有过滤网、500目筛和1000目筛，过滤网用于去除大块的组织材料，500目筛用于去除粒径较大的混杂细胞，1000目筛用于去除粒径较小的混杂细胞，在使用时，目标间充质干细胞(10μm-25μm)则被截留在1000目筛上表面。