[发明专利]犬科动物间充质干细胞库及其构建方法

权利要求书

1.一种犬科动物间充质干细胞库的构建方法，包括：

(1)筛选供者犬，从成年健康孕犬中选择体格检查合格的对象；

(2)取犬科动物胎盘、脐带，抽取胎盘血进行传染病检测，检测合格后，冲洗去除残留血液并浸泡胎盘脐带组织；

(3)将胎盘脐带组织进行粗剪，再次用磷酸缓冲液清洗，去除残留血液；

(4)将组织放入含有I型胶原酶和胰酶的混合溶液的容器中进行消化；

(5)对步骤(4)消化所得混合物进行过滤，得到间充质干细胞悬液；

(6)重复步骤(4)-(5)，直到收集足够间充质干细胞悬液，离心收集沉淀、重悬、接种培养传代；

(7)对细胞进行形态、表型和分化鉴定；

(8)将检定合格的间充质干细胞置液氮冷冻，按其种属进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出犬科动物间充质干细胞库。

2.如权利要求1所述的构建方法，其中步骤(4)使用的混合溶液包括体积比为1:1的I型胶原酶和胰酶，其中I型胶原酶质量体积比浓度为0.5％、胰酶质量体积比浓度为0.5％，所述混合溶液体积为组织体积的1/2。

3.如权利要求1所述的构建方法，其中所述步骤(6)按照步骤(4)-(5)重复3-5次。

4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(5)所述的过滤为将混合物依次通过500目筛和1000目筛，收集1000目筛上的细胞。

5.如权利要求1所述的构建方法，包括：

1)筛选供者犬，选择定期免疫的成年健康孕犬，并且体格检查合格；

2)通过剖腹产取犬科动物胎盘、脐带，使用注射器自胎盘中抽取胎盘血进行犬冠状病毒、犬瘟热病毒、狂犬病毒、犬细小病毒、犬布氏杆菌传染病检测，检测合格后，用含有庆大霉素和环丙沙星的磷酸盐缓冲液冲洗去除残留血液并浸泡胎盘脐带组织15分钟；

3)将胎盘脐带组织进行粗剪，剪成1-2cm³的小块，再次用磷酸缓冲液清洗，去除残留血液；

4)将组织放入含有I型胶原酶和胰酶的混合溶液的容器中，I型胶原酶和胰酶体积比为1:1，I型胶原酶质量体积比浓度为0.5％，胰酶质量体积比浓度为0.5％，混合溶液体积为组织体积的1/2，将容器置于恒温磁力搅拌器上消化30-40分钟，转速为90-120转/分钟，温度37度；

5)将步骤4)所得的消化混合物通过细胞过滤器，依次通过500目筛和1000目筛过滤，用含有10～15％狗血清的DF12培养基冲洗细胞过滤器1000目筛上的细胞，得到间充质干细胞悬液；

6)重复第4)-5)步骤3-5次，收集间充质干细胞悬液，2000rpm离心10min，弃上清，重悬于含有10～15％狗血清的DF-12培养基中，在37度5％CO₂细胞培养箱中培养传代；

7)通过7～10天的培养传代后，对细胞进行形态、表型和分化鉴定；

8)将检定合格的间充质干细胞置液氮冷冻，按其种属进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出犬科动物胎盘、脐带间充质干细胞库；

其中，步骤5)所述细胞过滤器包括：

一第一过滤器和一第二过滤器，所述第一过滤器与第二过滤器通过上螺旋口和下螺旋口连接；

所述第一过滤器1设置有上手持部位、金属过滤网和500目筛膜，所述第二过滤器设置有下手持部位和1000目筛膜。

6.一种犬科动物间充质干细胞库，根据权利要求1～5任一项所述的方法构建。

7.如权利要求6所述的犬科动物间充质干细胞库，其特征在于所述间充质干细胞库的细胞粒径为10μm-25μm。