[发明专利]一种检测水稻粒宽等位基因的特异性PCR分子标记和方法

权利要求书

1.使用特异性PCR分子标记检测水稻GW5/qSW5位点变异的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、DNA提取：将被测水稻的种子，在25-35℃下培养，发芽5-10天后，从幼苗中提取DNA；

B、PCR扩增：以提取的被测水稻的DNA为模板，分别使用引物P5和引物P9进行PCR扩增；

C、结果分析：取4μl扩增产物上样于2％琼脂糖凝胶电泳进行分析，在120V恒定电压下电泳2小时后，使用Dured核酸染料漂染，当被测水稻没有引物P5和引物P9的扩增产物时，被测水稻的基因型为GW5N；当被测水稻同时有引物P5和引物P9的扩增产物时，被测水稻的基因型为GW5K；当被测水稻只有引物P5的扩增产物没有引物P9的扩增产物时，被测水稻的基因型为GW5Z；

所述引物P5的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，引物P5的下游引物的序列如SEQID NO：2所示，引物P9的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，引物P9的下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示；

所述引物P5和引物P9的扩增片段长度分别为441bp和214bp；

在设计所述特异性PCR分子标记时，首先对黄华占、珍汕97B、特青、日本晴、松粳6号、密阳46、9311、协青早B和Kasalath这九个水稻品种的GW5/qSW5基因的主要编码区段的序列进行了测序，基于这九个水稻品种的GW5/qSW5基因序列设计了所述特异性PCR分子标记；

九个水稻品种的GW5/qSW5基因主要编码区段的序列如下：

9311水稻的GW5/qSW5基因序列如SEQ ID NO：5所示；

Kasalath水稻的GW5/qSW5基因序列如SEQ ID NO：6所示；

黄华占水稻的GW5/qSW5基因序列如SEQ ID NO：7所示；

密阳46水稻的GW5/qSW5基因序列如SEQ ID NO：8所示；

日本晴水稻的GW5/qSW5基因序列如SEQ ID NO：9所示；

松粳6号水稻的GW5/qSW5基因序列如SEQ ID NO：10所示；

特青水稻的GW5/qSW5基因序列如SEQ ID NO：11所示；

协青早B水稻的GW5/qSW5基因序列如SEQ ID NO：12所示；

珍汕97B水稻的GW5/qSW5基因序列如SEQ ID NO：13所示；

所述PCR扩增的扩增体系为：总体积为20μL，包括pH8.8 Tris-HCL 33.5mM、(NH₄)₂SO₄8.0mM、MgCl₂1.5mM、TWEEN-200.05％、dNTPs 0.2mM、上游引物和下游引物各3.3ng/μl、Taq DNA聚合酶2.0单位和模版DNA 50ng；所述PCR扩增程序为：在94℃温度下预变性2min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在62℃下退火45s，在72℃温度下延伸60s；完成30个循环之后，在72℃延伸8min，即完成PCR扩增程序。