[发明专利]基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及环境污染检测领域，具体涉及一种基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用。

背景技术

针对环境雌激素的污染问题主要采用化学检测的方法，如液相色谱和质谱联用法(HPLC-MS)等。这些方法的优点是灵敏度高，但这些方法所需的分析仪器价格昂贵，成本非常高，难以进行推广和普及。另外，这些方法对样品的要求较高。环境样品与一般样品不同，具有化合物种类繁多、含量低、样品组成复杂、具有流动性和不稳定性等特点。当待测污染物浓度低于现有方法的检出限或者样品复杂，机体干扰严重的情况下，直接测定是不可能的。与化学方法相比，生物检测可以避开成分检测，直接分析污染样品引起的生物学效应，可更直观的反映环境污染的危害程度。但目前的生物检测法尚处于初始发展阶段，极少有海水小型模式动物运用生物学检测。因而有必要开发基于海水生物活体模型的检测技术，从海水的综合生物学和毒理学活性来直接评估海水污染的健康危害程度。

海洋环境雌激素活体检测模型具有以下优势：1)体型较小，耐受力较强，可在实验室大规模饲养；2)雌鱼产卵量大，世代周期短，繁殖代数多；3)对盐度的适应范围宽泛，可开发成有别于淡水斑马鱼模型的活体检测模型，在各种盐度的环境条件下进行推广应用。

鱼类卵黄蛋白原特异性产生于雌性动物肝脏中，正常条件下，雄鱼和幼鱼体内很难检测到表达，但在雌激素暴露下，雄性和幼鱼也会产生应激而表达卵黄蛋白原。因而，雄鱼或幼鱼卵黄蛋白原的诱导可以指示环境中雌激素污染(Sumpter，J.P.and Jobling，S.Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment.Environ Health Perspect)。

目前国内外已针对卵黄蛋白原开发出类雌激素检测方法，但所选择的鱼类模型均为淡水鱼类，包括鲤科和鲟科鱼类(如专利公开号：CN101519650和CN1763090)。通过查阅文献(中国期刊网、中华人民共和国专利局专利检索、Science Direct、ISI Web of Science、Springer Journal、NCBI，等)，海水鱼类用于环境雌激素的检测方面的专利报道较少。选用的鱼类存活的水域有限，如海水和淡水要选用不同的鱼，不能广泛应用于海水淡水的水体，需要建立多个检测标准才能够初步了解污染浓度的区间，

此外，现有的技术检测使用的定量方法为相对定量，无法准确估算出水体污染浓度的准确区间。同时现有技术下关于活体鱼同时可测海水淡水激素污染情况的研究较少，现有技术也没有对雌激素污染后的鱼进行梯度的采样时间，确定雌激素最佳检测时间点，若在体内基因全部合成蛋白后，再进行定量，则结果不准确。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用。本发明实质是提供了一种检测各盐度条件下的环境雌激素污染的检测技术，并运用于海域的环境雌激素污染检测。本发明首次将金钱鱼(Scatophagus argus)作为该项技术的鱼类活体模型。方法上采用实时荧光定量PCR方法，检测幼鱼在环境样品注射后，卵黄蛋白原(vitellogenin，VTGAb)mRNA表达水平的变化情况，进而指示样品的雌激素污染。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、采用简并引物方法设计引物得到金钱鱼卵黄蛋白原VTGAb部分序列，再根据RACE方法得到VTGAb全长氨基酸序列；

S2、根据克隆的到的VTGAb全长的菌液提取质粒，根据片段长度和质粒浓度计算拷贝数后视为原液；将原液梯度稀释后使用VTGAb和EF1-a荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR后得出标准曲线图；

S3、选择未性成熟的金钱鱼，进行梯度雌激素注射，在不同时间点采样提取肝脏RNA，使用罗氏反转录试剂盒反转cDNA；

S4、以步骤S2获得的标准曲线图作为标准曲线，采用SYBR实时定量PCR方法检测VTGAb的表达，并以EF1-a为内参基因，对肝组织cDNA进行绝对定量，建立VTGAb转录水平的检测体系；