[发明专利]基于金钱鱼卵黄蛋白原基因在水域环境激素检测的应用

权利要求书

1.一种基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、采用简并引物方法设计引物得到金钱鱼卵黄蛋白原VTGAb部分序列，再根据RACE方法得到VTGAb全长氨基酸序列；

S2、根据克隆得到的VTGAb全长的菌液提取质粒，根据片段长度和质粒浓度计算拷贝数后视为原液，将原液梯度稀释后使用VTGAb和EF1-a荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR后得到曲线图；

S3、选择未性成熟的金钱鱼，进行梯度雌激素注射，在不同时间点采样提取肝脏RNA，使用罗氏反转录试剂盒反转cDNA；

S4、以步骤S2获得的曲线图作为标准曲线，采用SYBR实时定量PCR方法检测VTGAb的表达，并以EF1-a为内参基因，对肝组织cDNA进行绝对定量，建立VTGAb转录水平的检测体系；

S5、将未性成熟的金钱鱼放入待检测水体中48～72h时(采样提取肝脏RNA，反转为cDNA，根据步骤S4的方法以EF1-a为内参基因对待测样品进行荧光定量PCR检测VTGAb的表达量并分析VTGAb的表达水平，所得结果与步骤S4的检测体系对比，得出雌激素的污染浓度区间，进而分析水样的环境雌激素污染程度。

2.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S1中，VTGAb简并引物对序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S1中，VTGAb全长引物对序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S2中，VTGAb荧光定量PCR引物对序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S2中，EF1-a荧光定量PCR引物对序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

6.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S2中，PCR反应为二步法反应程序：95℃30秒预变性，95℃5秒变性，60℃34秒复性、延伸和收集荧光信号，共40个循环。

7.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S3中，所述雌激素为类固醇类环境雌激素。

8.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S3中，所述梯度雌激素注射指的是分别注射10、100、1000、1000ug/kg雌激素。

9.根据权利要求1所述的基于金钱鱼卵黄蛋白原基因对水域环境激素进行检测的方法，其特征在于，步骤S3中，所述不同时间点为24h、48h、72h和96h。