[发明专利]一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法

说明书

本发明公开了一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法。该方法包括以下步骤：S1，根据FFPE样本的内参基因设计产物长度为Mbp和Nbp的两对引物，其中，MN；S2，取不同降解程度的样本，使用qPCR方法进行定量，并使用人全基因组DNA标准品采用扩增Mbp产物的扩增引物进行标准曲线的绘制；S3，每个样本分别采用上述两对引物进行扩增，根据Mbp产物的浓度确定DNA的有效浓度，根据Mbp产物与Nbp产物的CT差值判断DNA的降解程度；以及S4，根据样本的检测结果及建库信息分析结果确定量化的判定标准。应用本发明的技术方案，能够精准测定FFPE DNA的有效浓度，并且量化其降解程度。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法。

背景技术

FFPE为福尔马林固定、石蜡包埋的样本。这类病理样本是珍贵且来源广泛的生物医学研究材料。而二代测序的不断发展及其在医学上的应用给临床复杂疾病的基因诊断和治疗带来了新的曙光。FFPE样本测序流程主要分为核酸提取、文库构建、上机测序及数据分析、解读四个部分。而提取的核酸的质量对建库的成功与否乃至下机数据的可靠性都起着重要的作用，因此对提取后核酸进行严格的质控就显得尤为重要。

而目前传统的核酸检测方法由于易受到杂质，高级结构等影响从而无法准确的评估FFPE样本的DNA有效浓度及完整性。

目前检测DNA浓度的方法主要为分光光度计法和Qubit荧光剂法。分光光度计是利用核酸分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(－C＝C一C＝C一)，能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光；核酸(DNA/RNA)的最大紫外吸收值在260nm处；遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。尽管紫外吸收定量法是最常用的一种DNA定量方法，但其读数并不可靠且不准确。紫外吸光度法能够检测吸光度为260nm的所有物质，包括DNA、RNA、蛋白质、降解核酸和游离核苷酸。因此其无法准确对FFPE样本的有效DNA片段进行定量。另一种常用的DNA定量仪器2.0/3.0荧光计采用专门研制的荧光检测技术，该技术采用只有与DNA结合后才发出荧光的分子染料；这些荧光染料只有与特异性的靶分子结合时，才能发出荧光信号，从而测定DNA浓度。但是其测定的浓度包含所有的DNA片段，包括降解的(如小于100bp)DNA片段。而这部分小片段对于DNA样本的后期建库是无意义的。Qubit荧光计定量受样本杂质的影响也较大。这两种方法检测的DNA浓度受DNA溶液中蛋白质等杂质的影响较大，因此定量不准确。

目前检测DNA完整性/降解程度使用较多的方法为琼脂糖凝胶电泳及安捷伦2100生物分析仪(Aligent Bioanlyzer 2100)。琼脂糖凝胶电泳是利用DNA片段迁移距离与碱基对的对数成反比，通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，得出未知片段的大小，进而对FFPE样本DNA的降解程度进行检测。但是该检测方法受杂质如蛋白质与DNA交联的影响较大，迁移率受到影响，从而无法准确判断其降解程度。而且该方法也不能对FFPE DNA样本的降解程度进行量化。Aligent Bioanlyzer 2100也存在着同样的问题，同时其仪器成本及检测成本也比较高。

为了精确检测FFPE样本DNA的含量及完整性，并且将其成本降至最低，从而为建库提供准确的指导，避免样本、时间、试剂、人力等成本的浪费，亟待开发新的检测FFPE样本DNA的含量及完整性方法和产品。

发明内容

本发明旨在提供一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法，以精确检测FFPE样本DNA的含量及完整性。