[发明专利]一种表达多肽PA1B的方法

说明书

本发明提供了一种高效表达多肽PA1b的方法，包括如下步骤：(1)目的基因PA1b的合成；(2)PA1b基因和载体的连接；(3)重组质粒PUSCN1‑PA1b的转化；(4)重组质粒的酶切、测序鉴定；(5)293F(人胚肾悬浮细胞)细胞的转染；本发明的主要发明要点在于首次采用人源哺乳动物细胞成功表达PA1b，表达的蛋白质量稳定，产品均一，纯度达到98％，并且本发明多肽PA1b蛋白能够应用于制造治疗糖尿病的药物和食品中，其制作成本比胰岛素低，并且比胰岛素方便，可发展为口服型，无毒副作用，在血糖水平低于生理水平是不发挥降血糖作用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达多肽PA1B的方法以及由上述方法制备的多肽PA1B在治疗糖尿病中的应用。

背景技术

豌豆白蛋白1b(pea albumin lb，PAlb)为含37个氨基酸的单链肽，分子量为3，742Da，第3,7,15,20,22和32位的氨基酸均为半胱氨酸，由3对二硫键构成胱氨酸结模体。该肽在植物体内参与生长和代谢的调节，其作用模式与动物体内胰岛素和胰岛素样生长因子作用类似。它在大豆种子中可结合7S Bg蛋白，7S Bg蛋白又可以结合动物胰岛素和胰岛素样生长因子，故PA1b又名为豆类胰岛素Leginsulin。

糖尿病是一种以高血糖为典型特征的代谢综合征。据WH02016年报告，全球糖尿病患者己达到4.22亿，中国糖尿病人己达到1.3亿，占人口总数的9.4。据WHO估计，2005-2015年，中国用于糖尿病及相关心血管疾病导致的经济损失达5577亿美元。虽然糖尿病的治疗与预防己得到全球高度重视，但是近年的多项调查表明，无论是欧美发达国家还是发展中国家，糖尿病控制状况均不容乐观。

目前糖尿病的治疗药物主要集中在胰岛素、磺脲类药物、GLP-1受体激动剂、DDP-W抑制剂、二甲双胍类、噻唑烷二酮类等。遗憾的是这些药物都存在比较明显的缺点，如二甲双胍类易导致乳酸血症，噻唑烷二酮类存在肝毒性以及骨质丢失等副作用，磺脲类药物长期服用易引起低血糖，而长期服用DDP-W抑制剂容易产生咳嗽，胰岛素则具有不能口服、使用不方便等先天缺陷。

近来，NMR研究显示，豆类胰岛素与胰岛素，Bg蛋白与胰岛素受体在空间结构上有相似之处。那么PA1b是否具有胰岛素样调节糖代谢功能？引起了研究者的兴趣。特别的是，这个植物多肽同时在动物胃肠道内被发现存在，它是否是新的类似肠促胰岛素多肽激素，同样也是令众多研究者感兴趣的问题。CN105944103A发现将具有降糖功能的大豆活性肽PAlb与其他降糖和/或降脂成分复配后不仅大大提高了降糖效果，减少用药剂量，而且复配药物具有保护胰岛细胞的功能；豆类胰岛素(PAlb)基因克隆、表达及融合蛋白纯化，《华中科技大学硕士学位论文》，杜雯，2005，第一次用基因重组法制备PA1b，为深入研究PAIb的功能，开发“胰岛素型”口服降糖药物提供了基础。

但现有的PA1b蛋白表达的方法还存在缺陷，其表达效率低下，纯度不高，质量不稳定，因此，开发高效稳定表达大豆活性肽PA1b的方法成为研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达多肽PA1B的方法，以解决现有技术所存在的表达效率低下的问题，本发明的方法具有表达稳定性好、安全性高、成本低以及易大规模生产；另外，由本方法制备的多肽PA1B在应用于治疗糖尿病中取得了良好的效果。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案为：

一种表达多肽PA1B的方法，包括如下步骤：

(1)目的基因PA1b的合成：查找PA1b基因序列，设计上下游引物；并以豌豆cDNA文库为模板，以上游引物、下游引物进行PCR扩增获得PA1b目的基因片段；