[发明专利]一种表达多肽PA1B的方法

权利要求书

1.一种表达多肽PA1b的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)目的基因PA1b的合成：查找PA1b基因序列，设计上下游引物；并以豌豆cDNA文库为模板，以上游引物、下游引物进行PCR扩增获得PA1b目的基因片段；(2)PA1b基因和载体的连接：将目的基因片段PA1b和载体PUSCN1分别用限制性内切酶BamHI和XhoI酶进行双酶切，然后通过T4连接酶将酶切后的基因片段PA1b和载体PUSCN1进行连接获得重组质粒PUSCN1-PA1b；

(3)重组质粒PUSCN1-PA1b的转化：将步骤(2)获得的重组质粒PUSCN1-PA1b采用热激转化的方式导入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行培养，之后提取重组质粒PUSCN1-PA1b；

(4)重组质粒的酶切、测序鉴定：将提取的重组质粒用BamHI和XhoI酶切，37℃酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果；酶切结果正确，将质粒送往测序机构进行鉴定以确定已连接的片段为所需的目的片段；

(5)人胚肾293F悬浮细胞的转染：在步骤(4)的鉴定结果通过后，将所述重组质粒PUSCN1-PA1b导入到人胚肾293F悬浮细胞进行转染，转染结束后，细胞继续培养7天，之后6000RPM离心10min并收取上清，镍离子柱亲和纯化PA1b蛋白，其纯度达到98％，经鉴定即为多肽PA1b；

其中，所述PUSCN1载体增加了WPRE元件；其次，PA1b的N端增加了人的IL2的信号肽；PUSCN1载体的结构如附图2所示。

2.根据权利要求1所述表达多肽PA1b的方法，其特征在于：所述上游引物为5-CGCGGATCCGCAAGCTGC-3，其酶切位点为BamHI；下游引物为5-CCGCTCGAGTTCCAGATGGATG-3，其酶切位点为XhoI。

3.根据权利要求1所述表达多肽PA1b的方法，其特征在于：所述PCR扩增的条件为：

95℃5min预变性，94℃30s、54℃30s、72℃50s，40个循环，72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述表达多肽PA1b的方法，其特征在于：所述步骤(5)中转染前细胞密度调为2.5×10⁶/mL。

5.根据权利要求1所述表达多肽PA1b的方法，其特征在于：所述转染是在如下条件下进行：细胞：质粒：PEI的比例＝1:3:9，转染的时间为7天。

6.根据权利要求1所述表达多肽PA1b的方法，其特征在于：所述步骤(5)中蛋白的鉴定过程为：将蛋白湿转入PVDF膜，然后孵育一抗，封闭之后再孵育二抗，利用ECL Reagent与二抗上的辣根过氧化物酶反应，产生发射波长为428nm的光波，此光经X光片感光记录下来，结果显示表达蛋白是多肽PA1b。