[发明专利]一种特异性DNA甲基化谱其建立方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种特异性DNA甲基化谱其建立方法及应用。

背景技术

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种由遗传和环境等多因素共同参与的慢性复杂性病变，其所致的心脑血管疾病严重危害了人类身体健康。近年来，随着人们生活水平的提高、饮食习惯的改变、工作压力的增加以及社会环境的变迁等因素影响，AS发病率呈明显上升的趋势，且发病年龄日趋年青化，AS所致的心脑血管疾病有可能成为世界范围内的首要致死致残的原因之一，因而早期发现、预防和控制动脉粥样硬化的发生和发展是目前临床科学的重要目标之一。但AS的早期分子诊断、机制及方法尚未完全阐明。目前，血管造影和颈动脉超声是诊断AS的重要手段，能够显示血管直径、血管狭窄程度和斑块晚期病变，长期以来都被作为冠状动脉、颈动脉以及周围动脉病变等解剖学诊断的金标准。但超声检测仅仅对已经发生了动脉结构改变的动脉粥样硬化有诊断意义，很难直接观察到尚未发生结构及电生理改变的动脉粥样硬化的病变；而血管造影虽然能较为直观的观察到已经发生的病变，但造影具有创伤性，尤其是那些对造影剂过敏、肾脏功能不好的患者无法适用。因此，寻找一种动脉粥样硬化发生发展的早期分子诊断标志物及简单易行、快捷无创的检测手段将对动脉粥样硬化的预防和诊断有着重要的意义。

DNA甲基化是指以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，经DNA甲基转移酶的调节，将供体的甲基转移到5’端CpG二核苷酸的胞嘧啶上，使之变为5-甲基胞嘧啶，其本质是DNA基因碱基序列本身没有改变而其功能发生的变化，是除遗传学调控基因表达外又一重要调控方式，主要受环境因素的影响，是联系遗传和环境因素的纽带。在细胞转化过程中，DNA甲基化现象比临床症状改变更早，是在疾病未出现临床症状前DNA甲基化已发生了典型改变。DNA甲基化模式改变，包括DNA甲基化程度升高和降低，高甲基化抑制基因的表达，而低甲基化则可促进基因的表达。在肿瘤的研究中发现，DNA甲基化异常是引起肿瘤的一个重要因素，已经在部分肿瘤的早期预测、分类及预后评估中进行了应用，而AS也属于多因素复杂性疾病，其发生发展的相关机制如血管平滑肌细胞增殖及表型转化、脂质浸润及内皮细胞损伤等都与其调控因子启动子区的CpG岛甲基化异常有关。在人类和ApoE基因敲除鼠的动脉粥样硬化斑块中存在广泛的基因组甲基化水平降低，使部分染色体发生微卫星不稳定，导致平滑肌细胞增生；AS病人的主动脉等组织中雌激素受体α基因的DNA甲基化水平升高；另外，在AS发生发展中，ATP结合盒转运子A1(ABCA1)、胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)等基因也存在DNA甲基化修饰状态的改变。由此可见，多个基因启动子区的甲基化改变是AS发生中的普遍现象，基因DNA异常甲基化有可能是动脉粥样硬化形成的早期生物学标志物，以高频率的基因CpG岛甲基化事件作为一种表遗传学标志，在AS的早期诊断与预后评估中具有重要的潜在价值。

以往对AS的研究中，大多局限于观察单个或少数基因甲基化与AS的关系，其基因表型和疾病表型间的复杂关系并不能通过将单个基因的独立作用进行简单的加和来充分解释，仅依靠单个或少数基因的异常甲基化状况不能准确判断AS的发展状况，因此，如能从多基因水平寻找出AS表遗传标志物，即建立AS早期诊断的特异性甲基化谱，对复杂疾病筛查的实际临床应用具有重要意义。但目前国内外尚无对AS特异的DNA甲基化谱的研究及其作为表遗传学标志与AS发生发展之间的关系的研究的公开报道，因此，找到有效的早期诊断方法和干预手段，指导AS的靶向性治疗及潜在的干预靶点，对提高人们生活水平和质量有不可估量的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性DNA甲基化谱其建立方法及应用，该方法该方法取材来自血液，患者普遍容易接受，简单易行，容易推广。

其具体技术方案为：

一种特异性DNA甲基化谱，包括TIMP-1、ACAT1、ABCA1三个基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

一种特异性DNA甲基化谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)筛选与动脉粥样硬化相关的候选基因；

(2)筛选动脉粥样硬化患者和与之匹配的正常人的血液标本,检测血脂水平并提取血液中单个核细胞的DNA,确定DNA的纯度和浓度；