[发明专利]人源肝细胞中Nrf1β基因定向敲除识别序列对、Talens、载体对及应用

说明书

本发明提供人源肝细胞中Nrf1β基因定向敲除识别序列对、Talens、载体对及应用，所述识别序列对由左臂识别序列和右臂识别序列组成，左臂识别序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，右臂识别序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述核酸酶Talens由识别SEQ ID NO.1核苷酸序列的核酸酶左臂Nrf1β‑Talen L和识别SEQ ID NO.2核苷酸序列的核酸酶右臂Nrf1β‑Talen R组成；所述载体对由Nrf1β‑Talen L载体和Nrf1β‑Talen R载体组成；所述载体对能在定向敲除人源肝细胞系中Nrf1β基因、构建Nrf1β基因敲除型人源肝细胞系中应用。

技术领域

本发明属于基因敲除技术领域，具体涉及人源肝细胞中Nrf1β基因定向敲除识别序列对、Talens、载体对及应用。

背景技术

核因子E2相关因子1(TCF11/Nrf1)具有抗氧化、抗炎症、调控蛋白质降解、糖脂代谢平衡等多种重要生理功能。但由于细胞中Nrf1蛋白存在多个亚型包括Nrf1α、Nrf1β、Nrf1χ、Nrf1D等以及多种翻译后修饰，使得Nrf1的功能未能得到透彻的研究。肝细胞系是研究Nrf1调控糖脂代谢的良好材料，目前市面上还未见有人源肝细胞系Nrf1敲出的细胞系出售，使得Nrf1对糖脂代谢调控的具体分子机制和信号通路比较模糊。

传统的研究方法中，使用siRNA干扰技术研究Nrf1功能的原理是通过降解细胞中Nrf1的mRNA，从而达到降低细胞中Nrf1蛋白质水平，而且不能完全消除细胞中的Nrf1，因此得出的研究结果不能排除残留的Nrf1蛋白的影响，此外siRNA技术还存在脱靶问题，siRNA技术的稳定性以及可重复性较差；利用同源重组系统基因敲出技术研究Nrf1则是在基因组上将Nrf1基因全部敲出，但此方法操作繁琐，在基因组上敲出片段较长可能导致转录失控，并且不能区分不同Nrf1亚基的功能。

如何使Nrf1的研究变的方便快捷，在不对基因组做出较大长度改变得遗传背景下达到Nrf1全部敲出，并且让研究结果稳定可靠可重复，是Nrf1研究领域亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明要解决的技术问题是：如何提供人源肝细胞中Nrf1β基因定向敲除识别序列对、Talens、载体对及应用，使该方法操作方便快捷，在不对基因组做出较大长度改变的遗传背景下达到将Nrf1β基因全部敲除，使肝细胞中不残留Nr f1β蛋白。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：基于Talen的人源肝细胞中Nrf1β基因定向敲除识别序列对，所述识别序列对由左臂识别序列和右臂识别序列组成；所述左臂识别序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述右臂识别序列的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

用于定向敲除人源肝细胞中Nrf1β基因的转录激活样效应因子核酸酶Talens，所述转录激活样效应因子核酸酶Talens由识别SEQ ID NO.1核苷酸序列的核酸酶左臂Nrf1β-Talen L和识别SEQ ID NO.2核苷酸序列的核酸酶右臂Nrf1β-Talen R组成；所述Nrf1β-Talen L由识别SEQ ID NO.1核苷酸序列的Tale-L和非特异性核酸内切酶Fokl融合而成，所述Nrf1β-Talen R由识别SEQ ID NO.2核苷酸序列的Tale-R和非特异性核酸内切酶Fokl融合而成；所述Tale-L的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Tale-R的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

用于定向敲除人源肝细胞中Nrf1β基因的载体对，所述载体对由Nrf1β-Talen L载体和Nrf1β-Talen R载体组成；所述Nrf1β-Talen L载体包含编码所述Tale-L的核苷酸序列，所述Nrf1β-Talen R载体包含编码所述Tale-R的核苷酸序列；所述Nrf1β-Talen L载体和Nrf1β-Talen R载体均带有嘌呤霉素抗性基因。