[发明专利]人源肝细胞中Nrf1β基因定向敲除识别序列对、Talens、载体对及应用

权利要求书

1.用于定向敲除人源肝细胞中Nrf1β基因的载体对在定向敲除人源肝细胞系中Nrf1β基因、构建Nrf1β基因敲除型人源肝细胞系中的应用，所述载体对由Nrf1β-TalenL载体和Nrf1β-TalenR载体组成；所述Nrf1β-TalenL载体或Nrf1β-TalenR载体带有嘌呤霉素抗性基因；所述Nrf1β-TalenL由识别SEQ ID NO.1核苷酸序列的Tale-L和非特异性核酸内切酶Fokl融合而成，所述Nrf1β-TalenR由识别SEQ ID NO.2核苷酸序列的Tale-R和非特异性核酸内切酶Fokl融合而成；所述Tale-L的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Tale-R的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述Nrf1β-TalenL载体为包含编码Tale-L的核苷酸序列的TALEN-LEFT载体；所述Nrf1β-TalenR载体为包含编码Tale-R的核苷酸序列的TALE-RIGHT载体。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述人源肝细胞为人源肝细胞HL7702细胞。

3. Nrf1β基因敲除型人源肝细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）采用转染法将权利要求1所述载体对转染入人源肝细胞中；

2）用嘌呤霉素筛选步骤1）转染培养后的人源肝细胞，得到成功转染Nrf1β-TalenL载体质粒和Nrf1β-TalenR载体质粒的人源肝细胞；

3）将步骤2）筛选成功的转染Nrf1β-TalenL载体质粒和Nrf1β-TalenR载体质粒的人源肝细胞用胰酶消化悬浮后，继续培养至单细胞克隆长成，挑取由单个细胞长成且细胞状态良好的群落继续扩大培养，得到所述Nrf1β基因敲除型人源肝细胞系。

4.根据权利要求3所述Nrf1β基因敲除型人源肝细胞系的构建方法，其特征在于，采用转染法将权利要求1所述载体对转染入人源肝细胞中的具体步骤为：

A、向细胞培养孔板中每孔加入人源肝细胞，采用DMEM培养基对所述人源肝细胞进行培养至所述人源肝细胞在孔板底部生长覆满80%后，将每孔中的DMEM培养基吸出并加入Opti-MEM，将细胞培养孔板中的各个孔分为转染组和对照组备用；

B、取Nrf1β-TalenL载体质粒、Nrf1β-TalenR载体质粒和Opti-MEM混合均匀，得到试剂1；其中，所述Nrf1β-TalenL载体质粒、Nrf1β-TalenR载体质粒和Opti-MEM的质量体积比为1.5μg：3μg：100μL；将Opti-MEM作为试剂2；将lipo2000和Opti-MEM以9：100的体积比混合均匀，得到试剂3；

C、将试剂1和试剂3等体积混合并静置15min后，加入步骤A转染组中，培养8h；将试剂2和试剂3等体积混合并静置15min后，加入步骤A对照组中，培养8h；

D、将培养结束后的转染组和对照组中液体吸出，并分别向转染组和对照组孔中各加入含10wt.%FBS的DMEM培养基，完成转染步骤。

5.根据权利要求3所述Nrf1β基因敲除型人源肝细胞系的构建方法，其特征在于，步骤2）中所述用嘌呤霉素筛选步骤1）转染培养后的人源肝细胞的具体步骤为：将嘌呤霉素加入含10wt.%FBS的DMEM培养基中混合均匀，得到含嘌呤霉素培养基，其中，所述嘌呤霉素在所述含嘌呤霉素培养基中的终浓度为2μg/mL；在人源肝细胞转染Nrf1β-TalenL载体质粒和Nrf1β-TalenR载体质粒48h后，用所述含嘌呤霉素培养基继续培养至对照组中人源肝细胞全部死亡为止，A孔中仍剩余存活的人源肝细胞即为成功转染Nrf1β-TalenL载体质粒和Nrf1β-TalenR载体质粒的人源肝细胞。

6.根据权利要求3所述Nrf1β基因敲除型人源肝细胞系的构建方法，其特征在于，所述人源肝细胞为人源肝细胞HL7702细胞。