[发明专利]一种猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法，属于兽用生物制品领域。

技术背景

猪圆环病毒2型(Procinecircovirus type 2，PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原。PMWS主要发生在5-12周龄的断奶仔猪，其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等。病原学及血清学调查研究表明，该病在许多国家广泛存在，给养猪业造成严重的经济损失。

PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种单股共价闭合环状DNA病毒，基因组含有1766～1768nt，结构简单，主要含有2个阅读框架(ORFs)：ORF1编码病毒复制相关蛋白Rep和Rep’，参与病毒复制；ORF2编码病毒衣壳蛋白Cap，是病毒的结构蛋白，与病毒的致病性和免疫原性有关。

根据病毒的抗原性和基因组成不停，可分为2种基因型或称血清型，即PCV1(Procinecircovirus type 1，PCV1)型和PCV2型，PCV1与PCV2的Rep蛋白之间具有较强交叉免疫反应，对以PCV2全病毒为诊断抗原的检测方法的准确性有一定的影响。Cap蛋白是PCV2唯一的结构蛋白，免疫原性和反应原性都较强，且PCV1和PCV2的Cap蛋白没有交叉免疫反应。因此，针对Cap蛋白诊断试剂的研究已成为热点。

自从首例PCV2感染的PMWS病例确诊以后，国内外学者对PCV2的诊断技术做了大量研究，相继研制出了PCR、免疫组化、间接免疫荧光(IFA)、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)和ELISA等检测方法，这些方法在诊断PCV2发挥着重要作用。ELISA检测方法具有诊断速度快、敏感性高、特异性强等优点，适合大规模检测，是一种便于普及的检测技术。本发明利用原核表达系统表达Cap蛋白，针对PCV2病毒的单克隆抗体作为酶标抗体建立阻断ELISA，具有特异性好，敏感性高的 特点，可用于临床猪血清样品PCV2抗体的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种规模化生产的检测猪圆环病毒2型抗体的阻断ELISA试剂盒，为临床检测猪圆环病毒2型提供快速、准确、简便的检测工具。

为了实现上述指标，本发明采取了如下技术方案：

1.一种猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒内含有：利用重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL-Cap-C株(保藏编号为CGMCC NO.4481)表达并经纯化的猪圆环病毒2型CapC蛋白作为包被板抗原制备的抗原包被板，辣根过氧化物酶标记的杂交瘤细胞3E5株(保藏编号为CGMCC NO.8169)制备的抗PCV2的单克隆抗体以及，样品稀释液、浓缩洗涤液(10×)、阳性血清对照、阴性血清对照、显色液、终止液。

2.本发明所述试剂盒，其特征在于所述所述的抗原包被板是用0.1mol/L，pH9.6的碳酸盐溶液作为包被液，将表达并纯化的CapC蛋白稀释至1～3μg/ml，包被ELISA酶标板；所述辣根过氧化物酶标记的杂交瘤细胞5H7株制备的抗PCV2的单克隆抗体；所述的阳性血清对照为经猪圆环病毒2型(SH株)免疫的高免猪血清；所述的阴性血清对照为未感染过猪圆环病毒2型和未经猪圆环病毒2型疫苗免疫的猪血清；

3.本发明所述试剂盒的制备方法，其特征在于所述猪圆环病毒2型CapC蛋白的制备方法包括以下步骤：

(1)一级种子制备用接种环取适量菌种，划线接种于含25～100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，置37℃静置培养16～24小时，挑选单个典型菌落，转接到含25～100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基内，37℃培养10～12小时，即为一级种子；

(2)二级种子制备将一级种子菌液按1％～2％比例接种于含25～100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养8～10小时，即为二级种子；

(3)目的蛋白诱导表达取二级种子按1％～2％量接种于含25～100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，180～200r/min，37℃摇床振荡培养3～5小时，菌液浓度OD600nm值为0.6～0.8时，向培养物中加入终浓度0.5～1.5mmol/ml的异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)，37℃振荡培养6～10小时，收获菌液；