[发明专利]一种猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒内含有：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)重组菌BL-Cap-C株(保藏编号为CGMCC NO.4481)表达的猪圆环病毒2型CapC蛋白，经纯化后作为包被板抗原制备的抗原包被板，辣根过氧化物酶标记的分泌PCV2抗体的杂交瘤细胞3E5株(保藏编号为CGMCC NO.8169)制备的抗PCV2的单克隆抗体以及样品稀释液、浓缩洗涤液、阳性血清对照、阴性血清对照、显色液、终止液。

2.如权利要求1所述一种猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的抗原包被板是用0.1mol/L，pH 9.6的碳酸盐溶液作为包被液，将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21-Cap-C株重组菌(保藏编号为CGMCC NO.4481)表达并纯化的CapC蛋白稀释至1～3μg/ml，包被ELISA酶标板；所述的阳性血清对照为经猪圆环病毒2型SH株免疫的高免猪血清；所述的阴性血清对照为未感染过猪圆环病毒2型和未经猪圆环病毒2型疫苗免疫的猪血清。

3.权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述猪圆环病毒2型CapC蛋白的制备方法包括以下步骤：

(1)一级种子制备用接种环取适量菌种，划线接种于含25～100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，置37℃静置培养16～24小时，挑选单个典型菌落，转接到含25～100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基内，37℃培养10～12小时，即为一级种子；

(2)二级种子制备将一级种子菌液按1％～2％比例接种于含25～100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养8～10小时，即为二级种子；

(3)目的蛋白诱导表达取二级种子按1％～2％量接种于含25～100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，180～200r/min，37℃摇床振荡培养3～5小时，菌液浓度OD600nm值为0.6～0.8时，向培养物中加入终浓度0.5～1.5mmol/ml的异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)，37℃振荡培养6～10小时，收获菌液；

(4)目的蛋白纯化将诱导表达的细菌于4℃8000～10000r/min离心5～10min，用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH值7.2)洗涤沉淀，重复2次，最后用适量PBS缓冲液重悬细菌沉淀，在200W功率的条件下超声波裂解细菌2～5min，直至菌液变得清澈；4℃8000～10000r/min离心5～10min，收集沉淀即为包涵体重组蛋白，再经包涵体洗液洗涤纯化。

4.权利要求1和2所述的一种猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在 于辣根过氧化物酶标记的抗PCV2的单克隆抗体制备方法如下：

(1)杂交瘤细胞株的筛选利用纯化的猪圆环病毒2型Cap蛋白经3次免疫BALB/c小鼠后，当小鼠血清ELISA效价达到1:6400以上时，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，用含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺(T)和甘氨酸的完全培养基(HAT选择性培养基)筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选，将筛选到的阳性杂交瘤细胞经三次有限稀释，获得1株能稳定分泌抗Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株，被命名为分泌抗Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞3E5株，该杂交瘤细胞株保藏编号CGMCC NO.8169，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

(2)小鼠腹水单克隆抗体的制备取10周龄BALB/C小鼠，腹腔内注射入0.5ml液体石蜡。7～10日后，每只小鼠腹腔接种3～5×10⁶杂交瘤细胞，隔离饲养一周后，收集腹水至离心管，3000r/min离心20min，取上清，56℃水浴30min；

(3)腹水单克隆抗体的纯化与HRP标记取3E5小鼠腹水单克隆抗体，用饱和硫酸铵沉淀方法和Protein A亲和层析纯化IgG，用戊二醛方法进行HRP标记，获得HRP标记抗体，置-70℃以下保存。

5.权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测试剂盒的应用，其特征在于该试剂盒的检测方法如下：

(1)使用前应将所有试剂恢复至室温(18～25℃)。将各试剂轻轻旋转或振荡，使之均匀；

(2)洗涤液配制将10倍浓缩洗涤液恢复至室温，并摇动使沉淀溶解，然后用去离子水作10倍稀释，混匀；

(3)用血清稀释液在稀释板内将待检血清1:1稀释，即每孔先加50μl样品稀释液，再加50μl待检血清，吸取每份样品时均应换用不同吸头，振荡混匀后，加入抗原板各孔；分别加入阳性血清对照、阴性血清对照，100μl/孔，重复2孔，37℃下孵育2小时；

(4)洗涤弃去孔中液体，每孔加入洗涤液约300μl，放置1min，弃去孔中洗涤液，重复5次，最后拍干；

(5)每孔加入100μl PCV2酶标抗体，37℃孵育30min；

(6)洗涤同步骤(4)；

(7)每孔加入100μl TMB底物液，37℃避光孵育10～15min，至阴性对照显蓝色，阳性对照基本不显色，每孔加入50μl终止液；

(8)酶联仪在450nm读数，尽量15min内完成；

(9)结果计算

阴性对照平均OD_450nm值(NC_X)NC_X＝(A1孔OD值+A2孔OD值)/2

阳性对照平均OD值(PC_X)PC_X＝(B1孔OD值+B2孔OD值)/2

样品阻断率的计算阻断率＝(NC_X﹣样品OD值)/NC_X×100％；

(10)结果判定NC_X大于0.7，PC_X小于0.4时，试验条件成立；当PI值≥38％判为阳性，PI值≤30％判为阴性，30％＜PI值＜38％判为可疑，对可疑样品重新检测一次；PI低于38％，判为阴性。