[发明专利]肠道及口腔菌群多样性及差异性的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于新一代高通量测序技术的疾病患者肠道及口腔微生物多样性及差异性的检测的技术和方法。

背景技术

人体大部分的生理功能是人本身与微生物群共同进化过种中形成的共生生活的结果，健康人体存在着多种正常的微生物群落，他们与宿主存在着共生关系，共同维护着宿主的生理平衡。一旦宿主与微生物之间共栖共生的稳态被打破，就会诱发多种人类疾病。目前已经认识到肠道和口腔微生物与人类健康和疾病的密切关系，因此，仅仅从人类自身角度出发来研究人类疾病远远不够，必须考虑到与人类共栖共生的肠道微生物的作用。

传统的研究微生物的方法主要依赖于分离培养技术，但是人体内可培养的细菌只占细菌总数很小一部分，大部分的微生物是难以培养的，故我们应用目前的分离培养技术很难深入了解人体菌群整体结构及其宿主之间的相互关系。随着分子生物学的发展，使人们全面了解各生境内的菌群结构和功能成为可能。

随着二代测序技术在疾病领域研究的发展，以微生物菌群为靶点的治疗方案就是精准医疗非常重要的一个体现。它主要以每位患者的个体化数据为基础，通过对病人身体相关微生物组如肠道，口腔，皮肤等进行大规模测序，生物信息学分析后并挖掘每位患者病理学、生理学和病理生理学等方面的特点，进一步制定出适合每位患者的独特的、最佳的治疗和预防方案，提高治疗的针对性，从而取得最优的疗效。

本发明以儿童自闭症为例进行说明。儿童孤独症或称自闭症，是一种广泛性发展障碍，以严重的、广泛的社会相互影响和沟通技能的损害以及刻板的行为兴趣和活动为特征的精神疾病。目前自闭症患者已达6700万人，中国的自闭症患儿也已超过100万人，且患病率逐年上升。自闭症的主要病症包括不正常的社交能力、沟通能力、兴趣及行为模式，其病因尚不明确。有研究显示，孤独症和肠道菌群失调有关。

发明内容

本发明的目的即在于提供一种针对疾病患者肠道及口腔菌群的多样性及差异性的检测方法。

本发明的再一个目的是提供一种通过设计特异性引物(人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补)，适用于多种类疾病患者肠道和口腔菌群的多样性及差异性的检测方法。

本发明的又一个目的在于为人们更好的了解肠道及口腔微生物以及与疾病之间的相互关系提供技术支撑和理论基础。

1.在本发明中，所述引物对(上、下游引物统称为一对引物)不限于由所述序列所示的两条单链DNA分子组成的引物对，只要是能够特异性扩增所有需要检验的微生物来源的引物对均可。

本发明提供了一种检测疾病患者肠道菌群的多样性及差异性的特异性引物对，其特征在于，所述引物对是能够特异性扩增所有需要检验的微生物来源的引物对。

本发明提供了一种检测疾病患者肠道菌群的多样性及差异性的特异性引物对，其特征在于，所述引物对是能够特异性扩增所有需要检验的微生物来源的引物对。所述引物对是由两条单链DNA分子序列组成的引物对。所述引物对

上游引物为：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGGTAATTGTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；

下游引物为：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNNNAGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

所述的引物对，用于生物技术及检测领域，通过二代高通量测序技术，精准检测疾病患者肠道菌群的多样性及差异性。

2.本发明还提供一种判定待测疾病患者体内肠道菌群的多样性及差异性的方法，其特征在于包括以下步骤，

(1)收集待测样本并进行微生物基因组DNA提取，得到基因组DNA提取液；

(2)对基因组DNA提取液进行检测确定样本中微生物基因组DNA的浓度和纯度；

(3)利用16SrDNA特异的V3-V4区引物对基因组DNA提取液进行PCR扩增，进行文库构建；

(4)利用Illumina MiSeq测序系统进行测序；

(5)利用FLASH，QIIME，usearch61进行生物信息学分析

3.本发明所述粪便样本的采集及粪便样本DNA的提取方法为：

(1)所述粪便样本的采集方法具体为：

1)将粪便排入一个清洁且干燥的容器内。注：容器内不能混入尿液。