[发明专利]一种轮虫的筛选方法

权利要求书

1.一种轮虫的筛选方法，用于筛选有性生殖倾向最低的轮虫，其特征在于，包括：

将多个目标轮虫品系分别于环境密度≤0.1ind./ml的条件下稳定化增殖2-4周，建立单克隆培养母种群，从所述单克隆培养母种群中选择带卵轮虫作为母体，使其于环境密度≤0.1ind./ml的条件下生产F1代轮虫幼体，将龄长<2h的F1代轮虫幼体分别放置于不同体积的轮虫培养液中单独培养，并使得各F1代轮虫在发育过程中经历稳定的种群密度，每天更换一次轮虫培养液；

将不同种群密度下培养的各F1代轮虫产生的F2代幼体分别挑出单独培养，计算各F1代轮虫对应的F2代有性个体比率，F2代有性个体比率是通过F2代有性雌体个数与F2代总雌体的个数的比值求得；

将F2代有性个体比率和对应的F1代种群密度进行非线性拟合，求得各F1代轮虫的有性生殖阈密度，其中，非线性拟合公式为其中，公式中y为有性个体比率，x为种群密度，各F1代轮虫的有性生殖阈密度是指非线性拟合公式中，当y为0.5时产生有性生殖的种群密度；

将多个目标轮虫品系的F1代轮虫的有性生殖阈密度进行比较，得有性生殖倾向最低的轮虫品系。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，F2代有性个体比率由以下方式获得：将挑出的F2代幼体分别置于第一细胞培养板内，所述第一细胞培养板的每个孔内添加有0.15-0.22ml的轮虫培养液，每24h更换一次轮虫培养液，直至可以通过F2代带卵情况分辨F2代为混交雌体或非混交雌体，通过混交雌体数量与雌体总数的比率得各F2代有性个体比率。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述目标轮虫品系由从野外采集的休眠卵置于盛有轮虫培养液的容器内，将容器放置于20-25℃，光周期L：D＝16:8、光照强度为1000-3000lx的恒温培养箱中孵化而得。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，将野外采集的休眠卵在孵化之前置于4-5℃的条件下保存。

5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，将孵化而得的每个轮虫单独转移至第二细胞培养板内，每孔加入2-5ml的轮虫培养液，每隔1-2天更换一次轮虫培养液，获得各轮虫的单克隆培养种群作为所述目标轮虫品系。

6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述单克隆培养种群的密度为≤1ind./ml，种群规模至少达到1000只个体。

7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，将所述目标轮虫品系进行稳定化增殖之前，于15-20℃之间，保持种群密度为1ind./ml的情况下稳定培养15-30天。

8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，将所述目标轮虫品系进行稳定化增殖之前，于15℃，保持种群密度1ind./ml的情况下稳定培养30天。

9.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，将所述目标轮虫品系进行稳定化增殖之前，在20℃，保持种群密度1ind./ml的情况下稳定培养15天。

10.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述轮虫培养液的原料包括CaCl₂·2H₂O、MgSO4·7H₂O、K₂HPO₄、NaNO₃、NaHCO₃、EDTA-Na、H₃BO₃、FeCl₃·6H₂O、MnCl₂·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、Na₃VO₄、维生素B₁₂、维生素B₁、维生素B₇、NaOH以及水。