[发明专利]一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基和使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞培养基，具体涉及一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基和使用方法，属于生物技术领域。

背景技术

成纤维细胞是构成皮肤真皮层的主要细胞，是真皮层产生胶原蛋白、弹性纤维蛋白以及其他ECM(细胞外基质)的主要细胞，胶原蛋白和弹性蛋白在皮肤组织中的作用就是形成皮肤支架，保持皮肤弹性。吸纳水分，使皮肤细腻、光滑、富有弹性。

所以成纤维细胞的正常增殖、分化维系着皮肤正常的结构和生理功能。随着年龄的增长，皮肤真皮层厚度变薄，真皮层内的成纤维细胞数量减少，从而引发一系列的皮肤问题：皱纹、没有弹性、松弛、干枯没有光泽等。解决这些皮肤问题的根源就是补充皮肤真皮层内的成纤维细胞。

目前批准的唯一一款成纤维细胞产品LIVIV，是将皮肤成纤维细胞经过分离培养注射到皮肤真皮层内，为在成年中改善中度至严重鼻唇沟皱纹(微笑线)的外观。细胞没有支架，注射之后很容易流失，从而失去效果。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基和使用方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本发明是利用成纤维细胞在培养过程中自身分泌的富含胶原蛋白、弹性纤维蛋白的细胞外基质成分为天然支架成分，制备成成纤维细胞膜片，即保证了成纤维细胞的活性，又解决了单纯成纤维细胞注射易流失的问题。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

作为本发明的第一方面，一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于，包括：

(2)基础培养基：H-DMEM或者DF12；

(2)添加组分：维生素C 50-100μg/ml，

表皮细胞生长因子(EGF)3-20ng/ml，

(3)血清5-15％。

还包括：(4)dispase II(麦约尔CEL078)；

(5)IV型胶原酶(GIBCO,17104-019)；

(6)0.25％胰蛋白酶；

(7)皮肤保存液。

其中，(1)基础培养基为H-DMEM(High Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium)、或者DMEM-F12；

形式：干粉(纯水、过滤)、液体；

提供状态：无菌

配置方法：向基础培养基粉末(例如H-DMEM)，加入无菌超纯水一部分，进行先溶解，然后根据培养基说明书规定的体积进行定容；

充分溶解后，0.22微米滤膜进行过滤、封装；

然后按照需求，在基础培养液中加入5％-15％的血清。

如果是液体H-DMEM，直接在容器中加入5％-15％的血清，混匀即可。

pH调节：使用pH试纸(或者pH电位计)测试培养基pH值，如不符合规定，可用10％的HCl或10％NaOH调节，直到符合配方要求，一般在pH 7.0-7.5之间。

其中，(2)添加组分按照培养基的终体积，配置。

其中，(3)血清的种类选自动物血清、胎牛血清、人血清，最佳的自体血清(临床使用)，血清的浓度5-15％；

提供状态：无菌、补体灭活

自体血清的制备：

5)血清分离：将血样进行分离；

6)过滤除菌：将步骤1)得到的样品0.22微米过滤器进行两次过滤；

7)血清灭活：将步骤2)得到的样品56℃水浴灭活热原至少30min，冰箱冷藏室保存待用；

8)紫外线照射：有时，在步骤3)获得的样品在使用或者封装前要紫外线照射。

(4)dispase II(麦约尔CEL078)配制

用电子天平秤取1g的dispase II粉末，用33ml的0.9％生理盐水完全溶解，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；配制成1g/33ml(24U/ml)的母液；母液放置在-20℃冻存；使用时将母液稀释至1.5-2.4U/ml的工作液。

(5)IV型胶原酶(GIBCO,17104-019)配制

用电子天平秤取1g的IV型胶原酶粉末，用100ml的0.9％生理盐水完全溶解，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；配制成1g/100ml(2100U/ml)的母液；母液放置在-20℃冻存；使用时将母液稀释至30-50U/ml的工作液。

(6)0.25％胰蛋白酶配制