[发明专利]一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基和使用方法

权利要求书

1.一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于，包括：

(1)基础培养基：H-DMEM或者DMEM-F12；

(2)添加组分：维生素C 50-100μg/ml，表皮细胞生长因子(EGF)3-20ng/ml；

(3)血清5-15％。

2.根据权利要求1所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：

还包括：(4)dispase II(麦约尔CEL078)；

(5)IV型胶原酶(GIBCO,17104-019)；

(6)0.25％胰蛋白酶；

(7)皮肤保存液。

3.根据权利要求1所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：其中，(1)基础培养基为H-DMEM(High Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium)、或者DMEM-F12；

无菌的干粉、液体状态。

4.根据权利要求3所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：基础培养基的配置方法是向基础培养基粉末(H-DMEM)，加入无菌超纯水一部分，进行先溶解，然后根据培养基说明书规定的体积进行定容；

充分溶解后，0.22微米滤膜进行过滤、封装；

然后按照需求，在基础培养液中加入5％-15％的血清。

5.根据权利要求3所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：基础培养基的配置方法是液体DMEM，直接在容器中加入5％-15％的血清，混匀即可，用HCL或者NaOH调整pH为7.0-7.5。

6.根据权利要求1所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：其中，(2)添加组分按照培养基的终体积，配置。

7.根据权利要求1所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：其中，(3)血清的选自动物血清、胎牛血清、人血清，最佳的自体血清(临床使用)，血清的浓度5-15％；

提供状态：无菌、补体灭活

自体血清的制备：

1)血清分离：将血样进行分离；

2)过滤除菌：将步骤1)得到的样品0.22微米过滤器进行两次过滤；

3)血清灭活：将步骤2)得到的样品56℃水浴灭活热原至少30min，冰箱冷藏室保存待用；

4)紫外线照射：有时，在步骤3)获得的样品在使用或者封装前要紫外线照射。

8.根据权利要求2所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：(4)dispase II(麦约尔CEL078)配制，用电子天平秤取1g的dispase II粉末，用33ml的0.9％生理盐水完全溶解，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；配制成1g/33ml(24U/ml)的母液；母液放置在-20℃冻存；使用时将母液稀释至1.5-2.4U/ml的工作液。

9.根据权利要求2所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：(5)IV型胶原酶(GIBCO,17104-019)配制，用电子天平秤取1g的IV型胶原酶粉末，用100ml的0.9％生理盐水完全溶解，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；配制成1g/100ml(2100U/ml)的母液；母液放置在-20℃冻存；使用时将母液稀释至30-50U/ml的工作液。

10.根据权利要求2所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：(6)0.25％胰蛋白酶配制，0.25mg的胶原酶溶解到100ml0.9％生理盐水中，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；分装置于5ml离心管中，放置在-20℃冻存。

11.根据权利要求2所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：(7)皮肤保存液的配制，将医用青霉素和链霉素配制成100ug/ml，在98ml的0.9％生理盐水中加入1ml的青霉素和链霉素。

12.一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1.人皮肤成纤维细胞原代培养

1.1双眼皮手术中切除的皮肤组织，放置在皮肤保存液中(生理盐水+双抗)运至GMP实验室，用含青链霉素的生理盐水冲洗3次；

1.2在皮肤组织中加入dispase II，其浓度为30-50U/ml，37℃消化30分钟，然后在超净工作台内用眼科剪和眼科镊将皮肤的表皮和皮下组织小心剥离，用生理盐水将真皮组织清洗干净至澄清；

1.3将真皮组织剪碎剪小，用IV型胶原酶，其浓度为600-800U/ml，37℃消化2小时；

1.4用生理盐水稀释胶原酶，离心，1000-1500rpm，5分钟，如此重复洗3次；

1.5基础培养基重悬沉淀，接种于100mm培养皿中，放置于5％CO₂，37℃的培养箱中培养；

2.人皮肤成纤维细胞传代培养

2.1待细胞融合度达到90％时，用0.25％胰酶在37℃培养箱中消化约3-5min，在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入基础培养液终止消化；

2.2离心，1300rpm，5分钟；

2.3弃去上清液，基础培养液重悬沉淀，用吸管吹打细胞，以1∶4比例接种至新的100mm培养皿中进行传代培养；

2.4待人成纤维细胞培养至4-6代时，用于成纤维细胞膜片制备；

3.成纤维细胞膜片制备

3.1取4-6代的成纤维细胞经过0.25％胰酶消化，1000-1500rpm离心；

3.2分别用基础培养基和添加组分的完全培养基重悬沉淀，吹打均匀；

3.3按照4*10⁴/cm²接种至培养皿中；

3.4间隔2-4天更换基础培养基和完全培养基；

3.5待细胞长至第八天时，可见添加完全培养基的培养皿底层细胞已形成膜片，膜片的边缘翘起来，用镊子可将整张膜片掲起。