[发明专利]一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT‑PCR诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明专利涉及兽医生物学技术领域的诊断技术，具体是一种鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒。

背景技术

腹泻是当前威胁养猪业的一类重要疾病，导致猪腹泻的原因很多，包括营养性、细菌性、病毒性和寄生虫等因素。其中，病毒性因素是非常重要的一种因素，近年来，引起猪腹泻最主要病毒为猪流行性腹泻病毒(PEDV)，它能引起猪的猪流行性腹泻(PED)，PED是猪的一种高度接触性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为主要特征，发生与流行呈现逐年上升的趋势，多发生于冬季12月至次年2月寒冬季节，也可发生于其它季节，各日龄猪均可感染发病，哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪的感染发病率可达100％，尤其哺乳仔猪受害最严重，母猪发病率为15-90%，给我国养猪业造成严重的经济损失。1978年，比利时和英国首次报道了猪流行性腹泻，此后在世界多国均见有PEDV感染的报道。1976年，中国首次出现PEDV感染的报道，自1980年后期呈现大面积流行。

目前尚无有效的药物治疗猪流行性腹泻，该病一旦爆发，给猪场造成毁灭性的打击，采用疫苗进行预防是控制该病的最有效的手段，弱毒活疫苗与灭活疫苗相比具有免疫作用时间长，免疫效果牢固，可形成局部和全身免疫等优点，

ORF3基因是PEDV的一个附属基因，编码码一种离子通道蛋白，与病毒的毒力有关，是造成强弱毒差异的主要基因，是弱毒株重要的分子标记。

目前国内外商品化的PEDV弱毒疫苗株均为ORF3基因缺失毒株，如我国的CV777株，日本的P-5V株和韩国的KPED-9和DR13株等，这些毒株的ORF3基因在245-294bp均存在核苷酸缺失，而缺失区域周围的序列却相对保守，不同毒株的 ORF3 基因相似性达到97.8%，在临床上如何区分疫苗免疫与流行毒株，对仔猪腹泻疫情的预警及猪场流行性腹病毒的净化具有重要意义。

目前，在国内有学者尝试建立相关的鉴别诊断方法，如修金生等建立了鉴别猪流行性腹泻病毒野毒和疫苗弱毒的荧光定量 RT-PCR 检测方法，对操作人员要求高，且成本较高，目前只应用于实验室检测，不适合基层兽医部门应用。李长龙、朱海侠等建立了鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗株与野毒株的 RT-PCR 检测方法，均为两步法RT-PCR检测方法，且没检测的敏感性进行研究，操作烦琐，扩增反应时间长，模板RNA的易降解。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的是目的在于提供一种用于鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，该试剂盒操作简便、灵敏度高、特异性好可快速、准确地区分猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和流行毒株，对猪场流行性腹泻病毒病的早期鉴别诊断、防控及净化有重要意义。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于鉴别猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和/或流行毒株一步法RT-PCR诊断试剂盒，该试剂盒包括20μL RT-PCR一步法酶、250μL 酶缓冲液、300μL RNaseFreedH₂O、40μL 混合引物、20μL阳性对照、20μL阴性对照、80μLDL2000及25μL6×LoadingBuff，

所述的引物 P1 序列为 ：5'-AGTCTGCCAACTTGTCTT-3'

所述的引物 P2 序列为 ：5'-AGTAAAAGCAGACTAAACAAAGCCT-3'

所述的阴性对照为灭菌的DEPC水。

所述的阳性对照为猪流行性腹泻病毒疫苗弱毒株和流行毒株RNA。

所述混合引物中各条引物的浓度均为15μmo1/L。

所述的RT-PCR一步法酶由PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNase Inhibitor组成，所述PrimeScript Rtase、DNA Polymerase和RNase Inhibitor的体积比为1:1:1。

所述的酶缓冲液由dNTP Mixture和One Step Enhancer Solution组成，所述dNTP Mixture的浓度为400μmo1/L。

所述RT-PCR反应体系为：反应在25 μL体系中进行，P1、P2引物各1μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 12.5μL、两种病毒RNA混合物各0.5μL，，加RNase Freed H₂O至25μL。