[发明专利]一种对超薄细胞的高精度轴向定位与成像方法与装置

说明书

本发明公开了一种对超薄细胞的高精度轴向定位与成像方法，通过将细胞的上下表面分为两个部分，分别对这两个部分进行不同方式的多角度照明得到与轴向位置相对应的荧光光强信息，再结合相应算法得到细胞内荧光颗粒的轴向信息，获取三维图像。本发明还公开了一种对超薄细胞的高精度轴向定位与成像装置，照明光通过1/4波片和二维扫描振镜系统在样品表面进行环状扫描同时改变入射角度，产生两种不同的照明方式，激发出荧光被CCD接收；结合收到的荧光强度与样品轴向位置之间的关系就可以实现对超薄细胞的高精度轴向定位。本发明装置简单，操作方便；利用激发光的不同入射角度对整个细胞的上部分和下部分都进行了高精度的定位和成像。

技术领域

本发明属于显微成像领域，尤其涉及一种结合旋转全内反射显微和干涉对比显微实现对超薄细胞的高精度轴向定位和三维成像的方法与装置。

背景技术

生物科学研究的发展使得对生物现象的观察趋向于更精确，即要求更高的分辨率。在传统的显微方法中，照明的时整个视场在在z轴方向上都被照明光束照明，z轴方向的分辨率和信噪比一直都做不高，因此需要一种仅观察超薄层样品结构的显微方法有，尤其是在一些与膜相关的生物现象的研究中。

统的一些提高z轴分辨率的技术手段包括光切片(Lightsheet)显微镜和全内反射显微镜(Tirf)。Lightsheet采用横向照明的方式，但由于衍射极限的存在横向照明的最细光束只能做到半波长量级，其z轴分辨率依然达不到仅观察细胞膜结构的要求，而且由于细胞的贴壁生长，光切片显微技术很难准确照明到相应的位置。Tirf利用全内反射产生的倏逝场沿z轴方向的衰减特性，通过改变全内反射的入射角度实现不同的衰减系数，从而在细胞与装在波片之间形成100nm厚的光场，这层光场恰好与细胞的贴壁生长时细胞膜的位置重合，实现了细胞膜的准确照明。由于激光散斑的存在会导致光场不均匀，因此产生了一种通过旋转照明均匀光场消除散斑的方法，即旋转全内反射显微镜(Ring-tirf)。

但这种方法的穿透深度最多为几百纳米，成像范围局限于细胞的下表面，无法对一个细胞进行完整成像，因此需要出现一种对细胞的上表面进行照明的方法。

发明内容

本发明提供了一种对超薄细胞的高精度轴向定位与成像方法与装置，可以利用全内反射和干涉照明方法实现对超薄细胞的高精度轴向定位与成像。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、操作方便等特点，可以很好地应用于荧光样品的检测之中。

一种对超薄细胞的高精度轴向定位与成像方法，包括以下步骤：

1)将激光器发出的激光光束进行准直；

2)对光束进行相应的偏振调制使其能够形成目标照明图案；

3)将调制后的光束通过二维扫描振镜系统和显微物镜聚焦到样品表面，实现在样品表面上的环形扫描和变角度扫描；

4)在二维扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光；

5)细胞下表面由入射角大于全内反射临界角的光全内反射产生的倏逝波照明，产生的荧光强度为：

其中θ为入射角，z为轴向深度，α为激发光的入射角，为激发光的方位角，I代表电场强度，ρ为考虑到发散角的激光光束强度的空间分布，Ω为光束的发散角，f为轴向的荧光分子强度。

考虑到有限的入射角和穿透深度，可以得到：

g＝Hf

其中g和f分别对应N个角度和N个深度的向量，H为N角度和N深度的信息组成的矩阵，与上述的算符均相关。因此可以将成像过程看做一个线性系统，通过求解逆问题的方式，从多角度图像中重建出细胞的三维荧光密度分布。

6)细胞上表面由入射角小于全内反射临界角的透射光与反射光干涉产生的图案照明，干涉产生的照明图案强度分布满足公式：