[发明专利]一种对超薄细胞的高精度轴向定位与成像方法与装置

权利要求书

1.一种对超薄细胞的高精度轴向定位与成像方法，其特征在于：

针对细胞的下表面，由入射角大于全内反射临界角的光产生的倏逝波进行照明；激发的倏逝波场沿着z轴发生指数衰减，对细胞的下表面照明激发荧光，通过改变照明角度改变衰减系数，实现z轴的差别照明，通过求解逆问题的方式，从多角度图像中重建出细胞下表面的三维荧光密度分布；

针对细胞的上表面，由入射角度小于全内反射临界角透射光和其被细胞上表面附近反射一次后的反射光干涉产生的图案进行照明；改变角度同样得到不同深度的荧光颗粒对应不同入射角度时被激发的荧光强度，通过求解逆问题的方式，得到细胞上表面的三维荧光密度分布；

根据采集到上表面和下表面产生的荧光光强信息，进行细胞的轴向定位与三维成像。

2.如权利要求1所述的高精度轴向定位与成像方法，其特征在于，当入射角度θ₁大于全反射角时，激发的倏逝波场沿着z轴发生指数衰减，对细胞的下表面照明激发荧光，通过改变照明角度改变衰减系数，实现z轴的差别照明和样品的三维成像。

3.如权利要求2所述的高精度轴向定位与成像方法，其特征在于，产生全内反射时，得到的图像为横向各位置光强轴向积分，其分布满足公式：

其中I(0,θ_i)为载玻片表面的电场强度，φ为探测器和荧光颗粒的量子效率，Q(z)和PSF(z)为光子收集效率和系统的点扩散函数，C(z)为荧光标记的细胞样品，z为离界面的轴向距离，d_p为穿透深度，θ_i为全内反射的激发角，n_i和n_t分别为盖玻片和样品的折射率。

4.如权利要求1所述的高精度轴向定位与成像方法，其特征在于，细胞上表面附近设置反射用的盖玻片。

5.如权利要求4所述的高精度轴向定位与成像方法，其特征在于，所述盖玻片的表面与细胞之间依次镀设用于增强反射效应的硅膜和二氧化硅膜。

6.如权利要求1所述的高精度轴向定位与成像方法，其特征在于，干涉产生的照明图案强度分布满足公式：

E～1+r^TEexp[iφ(H)]，

其中r^TE是与界面垂直的电场分量的菲涅尔反射系数，φ(H)是透射光与反射光之间的相位差；

与轴向位置H相关的φ(H)满足公式：

菲涅尔系数满足公式：

p₀＝n_Si cosθ_Si，p₁＝n_ox cosθ_ox，p₂＝n_b cosθ_b，

其中，λ为入射光真空中的波长，为特征矩阵M_TE的四个参数，k_i为不同材料中的波矢；n_Si，n_ox，n_b分别为硅、二氧化硅和样品中的折射率；θ_Si，θ_ox，θ_b分别为硅、二氧化硅和样品中的入射光角度；d_ox为二氧化硅膜层的厚度。

7.如权利要求1所述的高精度轴向定位与成像方法，其特征在于，采集荧光光强信息时，保持入射角度不变在显微物镜的后焦面上进行环形扫描，用于消除激光照明产生的散斑。