[发明专利]一种草酸脱羧酶的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种草酸脱羧酶的制备方法，首先构建包含芽孢杆菌属的酸诱导启动子和分泌信号肽以及在其调控下配置的真菌来源的草酸脱羧酶基因的重组表达质粒载体，用该载体转化可以在pH≤4.5下正常生长的的芽孢杆菌，制备草酸脱羧酶重组菌。将该重组菌在发酵培养基中培养补加酸后进行诱导，通过简单纯化回收产生的胞外草酸脱羧酶。本发明方法制备的胞外草酸脱羧酶用于诊断试剂原料，药物组合物、保健食品或特殊医学用途配方食品的原料。采用突变的酸诱导启动子替换重组表达载体中的原始酸诱导启动子，转化芽孢杆菌能获得更高的表达量。

技术领域

本发明涉及微生物酶制备技术领域，具体而言，涉及一种草酸脱羧酶的制备方法及其应用。

背景技术

草酸(Oxalic acid)，又叫乙二酸(Ethanedioic acid)，是生物体的一种代谢产物，广泛分布于植物、动物和真菌体中，并在不同的生命体中发挥不同的功能。研究发现至少有100多种植物富含草酸，尤以菠菜、苋菜、甜菜、马齿苋、芋头、茶叶、可可、甘薯和大黄等植物的叶片和种子中含量最高，由于草酸可降低矿质元素的生物利用率，在人体中容易与钙离子形成草酸钙导致肾结石，所以草酸往往被认为是一种矿质元素吸收利用的拮抗物。草酸在人体内不容易被氧化分解掉，经代谢作用后形成的产物，属于酸性物质，可导致人体内酸碱度失去平衡，吃得过多还会中毒。而且草酸在人体内如果遇上钙和锌便生成草酸钙和草酸锌，不易吸收而排出体外，影响钙与锌的吸收。儿童生长发育需要大量的钙和锌，如果体内缺乏钙和锌，不仅可导致骨骼、牙齿发育不良，而且还会影响智力发育，过量摄入草酸还会造成人体内血液和尿液中的草酸含量过高，容易与钙离子形成不溶性的草酸钙晶体，草酸钙晶体很容易形成泌尿系结石。因此，控制从饮食中摄取的草酸，很大程度上就可以降低尿草酸量，从而降低患结石风险。低草酸饮食或降解食物中草酸的防治草酸钙结石的策略在医学界已成为共识。

泌尿系结石是泌尿系统的常见病和多发病，该病的主要特点是临床治愈后复发率较高，给患者带来了极大的痛苦，给家庭带来了沉重的心理和经济上的负担。草酸钙是泌尿系结石的主要成分，占比达80％，导致草酸钙结石症的重要原因是人体内缺乏降解草酸的代谢途径。近年来，研究酶法降解草酸预防治疗草酸钙结石症成为该领域的研究热点(贺俊斌,林日辉,龙寒等.草酸降解酶预防治疗草酸钙结石症的研究进展.[J]广东医学,36(7):1132-1136)。

目前生物界降解草酸的酶包括草酸氧化酶(Oxalate oxidase,EC 1.2.3.4)、草酸脱羧酶(Oxalate decarboxylase,EC 4.1.1.2，以下简称OXDC)和草酰辅酶A脱羧酶(Oxaly1-coenzyme A decarboxylase,EC 4.1.1.8)。OXDC是将草酸分解为甲酸和二氧化碳的酶，其内部含有锰。迄今已知，许多细菌如芽孢杆菌(Bacillus)属，集胞藻和乳酸菌属等、霉菌如曲霉(Aspergillus)属等、金针菇(Flammulina velutipes)，彩绒革盖菌(Coriolusversicolor)，疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria),白腐菌(Trametes versicolor),褐腐菌属(Monilinia)等含有草酸脱羧酶基因(以下也称“oxdc基因”)。

草酸脱羧酶在上述物种中的表达量极低，而且多数菌种生长缓慢，成分复杂，分离提取纯化十分困难，不具备商业化应用可能，所以将草酸脱羧酶进行重组表达生产成为其商业化应用的必然选择。目前草酸脱羧酶中实现原核重组表达的还比较少，多数是在大肠杆菌中进行重组表达。金针菇来源的OXDC有通过烟草表达成功过报道，但表达量极低。但目前用芽孢杆菌中表达系统表达外源的OXDC尚未见有文献报道，尤其是来源于真核生物的OXDC。另外，大肠杆菌中表达真菌来源的OXDC存在酶活力低，不能实现分泌表达，非常易于形成包涵体，复性和纯化困难，用作食品原料和药物原料的OXDC在生产纯化过程中需要去除内毒素。真菌来源的OXDC多数在酸性pH条件下活力较高且较为稳定，溶解状态的OXDC对环境的pH比较敏感，而枯草芽孢杆菌中的最适生长pH一般在6.5-7.5之间，pH低于5.5几乎不生长，因此在枯草芽孢杆菌中和其它芽孢杆菌系统中表达真菌来源的OXDC还没有成功的案例。