[发明专利]高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法

说明书

本发明涉及一种高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法，包括将鸡胸肌组织剪成肉糜，用I型胶原酶消化后离心；吸取上层成熟肌内脂肪细胞，接种于培养瓶，去分化处理，最终获得鸡前体肌内脂肪细胞；将离心后下层细胞沉淀重悬，差速贴壁纯化细胞，得到高纯度的肌卫星细胞，将前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞分别接种于transwell小室或配套的培养板，构建共培养体系。该发明方法突破了一直以来无法单独分离纯化鸡前体肌内脂肪细胞的技术瓶颈，可应用于量化模拟鸡肌肉组织，体外精准研究鸡肌内脂肪细胞与肌细胞之间的相互影响关系及分子调控机理，以及相关营养素或药物的筛选研发。

技术领域

本发明涉及细胞学领域，具体涉及鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化，并构建鸡前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞共培养体系的方法。

背景技术

动物脂肪主要分布在内脏周围、皮下和肌肉等组织部位。其中，肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)是指沉积于肌内膜或肌束膜内外的脂质，可以影响肌肉品质(嫩度、口感、风味)。在一定范围内，肌内脂肪的含量越高，肉的品质就越好；然而，鸡腹部脂肪蓄积过多会降低饲料的利用效率，也会额外增加加工费用，并造成一定的环境污染。因此，肌内脂肪和腹脂沉积涉及肉品质与生产效率两个指标，其均衡调控是肉鸡生产中重要科学命题。高肌内脂肪、低腹脂的体脂分布是优质肉鸡胴体性状改良的理想目标之一。

与猪、牛、羊等家畜不同，鸡肌内脂肪组织分布不均匀，一般不可见，无法直接采集纯的脂肪组织；另外，由于从肌肉组织分离前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞的密度差异不大，只能获得细胞的混合物。所以一直以来无法有效分离高纯度的前体肌内脂肪细胞。这一技术难题极大地限制了体外开展针对鸡肌内脂肪细胞、鸡肌内脂肪细胞与肌细胞之间的相互影响关系及分子调控机理，以及相关营养素或药物的筛选研发等方面的研究工作。

过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activatedreceptor，PPARγ)、脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase，LPL)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding protein 4，FABP4)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，FASN)、乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)、肉碱软脂酰转移酶-1b(Carnitinepalmitoyl transferase-1b，CPT-1b)是脂肪细胞的标志性基因。其中，LPL是脂肪细胞早期分化的标志性基因；PPARγ是脂肪开始生成转录的标志性蛋白；FABP4作为脂肪酸结合蛋白家族中的一员，在脂肪细胞分化过程中起着转运脂肪酸的关键作用；FASN和ACC是脂肪细胞分化过程中调控脂肪酸合成的关键酶；而CPT-1b则在脂肪酸氧化供能过程中的关键调控作用。

本发明提供了一种可以分离获得高纯度的鸡肌内前体脂肪细胞，并高效、量化模拟体内肌肉组织细胞发育环境的鸡肌内前体脂肪细胞和肌卫星细胞的共培养体系；并针对上述相关的标志性基因鉴定鸡前体脂肪细胞，鸡前体脂肪细胞的增殖、分化和传代能力，以及构建的共培养体系的有效性。

发明内容

本发明的目的是提供一种高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法，该发明方法突破了一直以来无法单独分离纯化鸡前体肌内脂肪细胞的技术瓶颈，可应用于量化模拟鸡肌肉组织，体外精准研究鸡肌内脂肪细胞与肌细胞之间的相互影响关系及分子调控机理，以及相关营养素或药物的筛选研发。

本发明所述方法包括将鸡胸肌组织剪成肉糜，用I型胶原酶消化后离心；吸取上层成熟肌内脂肪细胞，接种于培养瓶，去分化处理，最终获得鸡前体肌内脂肪细胞；将离心后下层细胞沉淀重悬，差速贴壁纯化细胞，得到高纯度的肌卫星细胞，将前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞分别接种于transwell小室或配套的培养板，构建共培养体系。

具体地，本发明上述方法包括以下步骤：