[发明专利]高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法

权利要求书

1.一种高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将10-21日龄北京油鸡放血致死，于75％酒精溶液中完全浸泡消毒5min，于细胞室无菌超净工作台进行分离细胞工作；用无菌的剪刀和镊子去除胸部皮肤、皮下脂肪和结缔组织；眼科剪取下胸大肌，迅速放入含有双抗的PBS缓冲液中清洗3次，再将肌肉组织剪成1mm³大小的肉糜后，移入10ml离心管中，加入含1％双抗的PBS溶液静置1分钟，待肌肉组织沉淀，弃上层液及漂浮组织；再加入9倍体积的质量体积比为0.1％的I型胶原酶，于37℃水浴中振荡消化30min，肉眼可见胶原酶消化液变粘稠后，然后加入同体积含10％FBS的DMEM/F12培养基中止消化；其中双抗具体为：青霉素100U/ml和链霉素100U/ml；

(2)将细胞悬浮液依次用100目、200目和600目的不锈钢筛过滤，收集滤液，1500r/min离心10min；吸取上层白色或黄色的成熟脂肪细胞，接种于细胞培养瓶，并灌满DMEM/F12培养基使细胞保持去分化状态；在37℃，5％CO₂培养箱中倒置培养去分化状态的细胞3-5天至出现前体脂肪细胞形态，更换培养基以去除细胞排出的脂滴和其他杂质；正置继续培养7-10天，获得高纯度的鸡前体肌内脂肪细胞，其中DMEM/F12培养基具体成分为：89％DMEM/F12+10％FBS+1％双抗；

(3)将步骤(2)离心后所得细胞沉淀用含10％FBS的DMEM/F12培养基重悬，再离心、 弃上清，再次重悬细胞并接种于培养皿中，使用含10％FBS的DMEM/F12培养基培养；利用细胞差速贴壁法进一步筛选，差速贴壁2h后，吸出培养基并重新接种，继续培养得到进一步纯化的肌卫星细胞；

(4)将肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞分别接种于transwell小室或配套的培养板中，共同在DMEM/F12培养基中培养，即可获得高纯度的鸡前体脂肪细胞和肌卫星细胞的共培养体系；接种的鸡前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞均使用第2代细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中研究前体肌内脂肪细胞时，肌卫星细胞接种于transwell小室，前体肌内脂肪细胞相应地接种于配套的培养板；研究肌细胞时，前体肌内脂肪细胞则接种于transwell小室，肌卫星细胞接种于配套的培养板。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，研究前体肌内脂肪细胞和肌细胞增殖时，使用含有10％FBS的DMEM/F12培养基；研究前体肌内脂肪细胞分化时，使用含有10％FBS和分化诱导剂的DMEM/F12培养基；研究肌细胞的分化时，使用含有2％马血清的DMEM/F12培养基。