[发明专利]利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用。所述菌株是在大肠杆菌染色体上异源表达来自伸长盐单胞菌中的ectABC基因簇，重构四氢嘧啶合成通路，构建无质粒系统，利用木糖启动子诱导来源于T7噬菌体的RNA聚合酶，同时结合T7强启动子系统启动目的基因高效表达，从而达到摇瓶发酵20‑28h后四氢嘧啶的产量达到了12‑16g/L，5L发酵罐发酵24‑40h后四氢嘧啶的产量达到了35‑50g/L的效果。

技术领域：

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

四氢嘧啶(1,4,5,6-2-甲基-4-嘧啶羧酸)，是由N-乙酰化的二氨基丁酸通过分子内脱水而形成的一种环状氨基酸，最早作为一种渗透压补偿性溶质，发现于能进行光合作用的极端外硫红螺菌。经过多年的研究，学者们在不同的嗜盐真菌中也发现了四氢嘧啶。

近来，四氢嘧啶的渗透保护功能以及在其他领域内的应用越来越受到人们的重视。研究发现，四氢嘧啶可以作为稳定剂去保护和稳定酶、核酸、DNA等生物大分子抵抗高温、干燥、高渗、冷冻等不良环境。目前四氢嘧啶已经在酶制剂、基因工程、医疗、化妆品等领域有着重要的用途。

在酶制剂领域的应用：通常工业生产过程中，工艺的理化条件并不能保证总是处在酶反应的最佳条件，这就需要酶制剂能够在不同的温度和盐度等逆环境下保持良好的活性，而四氢嘧啶能够帮助这些蛋白质大分子在逆环境下保持活性。

在基因工程技术领域的应用：目前，控制四氢嘧啶合成的基因已经在烟草中得到表达，虽然其表达量比较低，但是烟草的耐盐性还是有着一定的提高；此外，四氢嘧啶还能降低DNA的Tm值；对于高G+C含量的模板双链DNA，进行PCR扩增时，如果反应体系加入四氢嘧啶，能够促进PCR反应的进行；

在医疗领域的应用：四氢嘧啶不仅可以作为化疗过程中健康细胞的保护剂，同时对老年痴呆症和帕金森氏病也有一定的预防效果；

在化妆品中的应用：基于四氢嘧啶的渗透保护功能，四氢嘧啶可以作为保湿剂添加在化妆品中，既能防止皮肤干燥和衰老，又能减少紫外线对皮肤的伤害。

目前四氢嘧啶的生产方法包括发酵法、酶催化法。其中，嗜盐微生物中具有四氢嘧啶的合成途径，因此广泛应用于四氢嘧啶的发酵法生产中。嗜盐菌的四氢嘧啶合成途径为：草酰乙酸—天冬氨酸—天冬氨酸-β-半醛—L-2,4-二氨基丁酸—Nγ-乙酰二氨基丁酸—四氢嘧啶。Grammann等从伸长盐单胞菌中发现了与以往任何渗透调节都不同的系统，包括ectA、ectB、ectC三个基因，这三个基因组成一个操纵子，受共同的启动子调控，分别表达L-2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶、L-2,4-二氨基丁酸转氨酶和四氢嘧啶合成酶。

本发明将来源于嗜盐菌中的四氧嘧啶合成基因ectABC转入非嗜盐菌，在非嗜盐菌中重构四氢嘧啶的合成通路，重组的菌株在中度盐离子浓度或者是低的盐离子浓度的胁迫下就能以葡萄糖为原料催化合成四氢嘧啶。

此外，本发明还敲除了乙醛酸循环控制基因iclR以打开乙醛酸循环，增加前体物草酰乙酸的积累量；敲除编码高丝氨酸脱氢酶I的基因thrA，阻止L-天冬氨酸-β-半醛向分支代谢产物苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸的支路代谢，使代谢流更多的流向四氢嘧啶途径；通过替换T7强启动子增加目的基因ectABC的表达强度，提高关键酶的活性以增加四氢嘧啶途径的代谢通量；通过替换T7强启动子增加目的基因lysC的表达强度，解除赖氨酸对四氢嘧啶合成途径中的关键酶天冬氨酸激酶Ask的反馈抑制，同时回补天冬氨酸激酶，可以实现四氢嘧啶的过量积累；利用木糖启动子(PxylF)诱导来源于T7噬菌体的RNA聚合酶(T7RNAP)，同时结合T7强启动子(Pt7)系统启动目的基因以增强外源基因的表达强度。

发明内容：