[发明专利]利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其应用

权利要求书

1.一株生产四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以E. coli W3110，编号ATCC 27325为宿主细胞，其仅包含如下改造：T7启动子控制的来自伸长盐单胞菌的ectABC基因；thrA、iclR 两个基因缺陷型；T7启动子控制的来自谷氨酸棒状杆菌的lysC基因；trc启动子控制的ppc基因；木糖启动子PxylF控制的来源于T7 噬菌体的RNA聚合酶；

所述ectABC基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示;

所述lysC基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2所示;

所述thrA基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3所示;

所述iclR基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.4所示;

所述ppc基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.8所示。

2.如权利要求1所述的一株生产四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，所述伸长盐单胞菌编号CGMCC No. 1.6329。

3.如权利要求1所述的一株生产四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，

所述T7启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5所示;

所述trc启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.7所示;

所述PxylF的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.9所示;

所述来源于T7 噬菌体的RNA聚合酶的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.10所示。

4.权利要求1所述的一株生产四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

（1）以 E. coli W3110为出发菌株，敲除thrA、iclR 基因；

（2）ppc 基因启动子的替换为trc 启动子

（3）T7 RNA聚合酶的表达：构建木糖启动子PxylF和T7 RNA聚合酶T7RNAP的连接片段，并表达；

（4）L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的代谢途径的构建：

①构建T7启动子和ectABC基因的连接片段T7-ectABC，并表达；

②构建T7启动子和lysC基因的连接片段T7- lysC，并表达。

5.权利要求1所述的一株生产四氢嘧啶的基因工程菌在生产四氢嘧啶中的应用。

6.权利要求5所述应用，其特征在于，摇瓶发酵生产四氢嘧啶步骤如下：

（1）种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，37℃，200 rpm培养7 h；

（2）摇瓶发酵培养：按10-15%接种量接种发酵培养基，37℃，200 rpm培养20-28 h；维持pH在7.2，缺糖时补加60%葡萄糖溶液维持发酵进行，发酵初始添加终浓度5-15 g/L的木糖溶液诱导目的基因表达。