[发明专利]一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂领域和基因疫苗载体给药领域，具体涉及一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统及制备方法。

背景技术

疫苗是预防和治疗癌症、丙型肝炎、艾滋病、流感等疾病的有效方法。而DNA疫苗相比于传统疫苗，具有稳定、易于修饰与制备、安全性、能形成长期体液免疫和细胞免疫等方面的优势，而成为疫苗发展的新方向。然而，DNA疫苗的递送过程存在酶解、低吸收、转染效率低、抗原递呈不足等方面的风险。因此，选择合适的DNA疫苗递送载体对于发展至关重要。

首先，将DNA疫苗靶向递送至抗原递呈细胞，如巨噬细胞和树突细胞能显著提高摄取与递呈效率。CN 104771764A公布了一种巨噬细胞靶向载体系统，通过甘露糖修饰载体靶向抗原递呈细胞表面过量表达的甘露糖受体。然后，DNA疫苗进入内涵体-溶酶体系统，突破溶酶体进入细胞质是DNA疫苗所编码抗原表达的必要步骤。电荷反转材料能响应环境pH的变化，通过化学键的断裂改变自身电性，pH响应型释放DNA。最后，带正电荷的DNA载体材料通过质子海绵效应突破溶酶体到达细胞质，使DNA进入细胞核进行表达。具有仿病毒结构的两亲性树状脂肽其兼具非病毒载体的安全性和病毒载体的高转染效率。高转染效率有助于表达足量抗原，触发后续的主要组织相容性复合物I介导的细胞免疫和主要组织相容性复合物II介导的体液免疫。

虽然靶向性材料、电荷反转材料、DNA载体材料能分别发挥其作用，但是要将它们有机地结合起来并根据递送过程中的环境变化发挥程序化转染的作用仍然需要借助层层自组装的技术。层层自组装是利用静电作用将带正电荷和带负电荷的聚合物依次沉积于内核表面。通过调整聚合物的浓度与用量避免聚沉而形成稳定的纳米粒。层层自组装技术是一种成熟的技术，已被广泛地应用于药物、蛋白、基因递送系统的构建中。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的是通过层层自组装构建一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统，降低细胞毒性，提高转染效率，进而增强后续的免疫反应。

为实现上述目的，本发明采用的方案如下：

一种树突细胞靶向的pH响应型DNA疫苗递送系统，包括DNA载体材料DSPE-G2、电荷反转材料PAH-Cit和靶向性材料MCS，其特征在于，由两亲性的树状脂肽DSPE-G2压缩DNA形成的正电性纳米粒作为层层自组装的内核，在其表面覆盖阴离子聚电解质PAH-Cit作为电荷反转层，再在其表面覆盖阳离子聚电解质MCS作为外层靶向树突细胞。从而形成粒径为256.8±10.7nm、分散系数为0.104、表面电位为25.1±2.3mV的四元复合物纳米粒。

所述的DSPE-G2的结构为：

所述的电荷反转层PAH-Cit在酸性条件下酯键断裂，脱去柠康酰支链，形成阳离子聚电解质聚丙烯胺。

所述的外层MCS具有靶向树突细胞表面甘露糖受体功能，进而促进受体介导的内吞作用。

为实现上述目的，本发明采用的制备方法如下：

a、DNA载体的制备：将2mg DSPE-G2溶于100μL氯仿/甲醇(v/v＝4∶1)中，注入1mL快速搅拌中的HEPES缓冲液(10mM，pH 7.4)中，持续搅拌6h除去有机溶剂。

b、二元复合物的制备：将pDNA溶于HEPES缓冲液(10mM，pH 7.4)中，调整浓度为0.2mg/mL。将pDNA溶液与浓度为0.1-2mg/mL的DSPE-G2溶液等体积混合，涡旋1min，室温孵化20min。

c、三元复合物的制备：将PAH-Cit溶于HEPES缓冲液(10mM，pH 7.4)中，调整浓度为1mg/mL、2mg/mL。取50-200μL PAH-Cit溶液与100μL二元复合物溶液混合，室温孵化30min。

d、四元复合物的制备：将MCS溶于1％(v/v)醋酸溶液，静置过夜，用1M NaOH调节pH＝5.5，过0.8μm滤膜，调整浓度为0.5mg/mL。取150-300μL三元复合物溶液逐滴加入300μL搅拌中的MCS溶液，持续搅拌30min。

在上述制备过程中，不同浓度DSPE-G2与pDNA复合的N/P比为1-20，优选的N/P比为20。

在上述制备过程中，PAH-Cit与二元复合物需按照DSPE-G2与PAH-Cit的浓度比为1∶1，质量比为1∶1的比例混合。

在上述制备过程中，MCS与三元复合物需按照PAH-Cit与MCS的浓度比为4∶1，质量比为2∶3的比例混合。