[发明专利]黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法。本发明引物组合物包括10种自噬作用关键基因与RNA内参的RT扩增引物和PCR扩增引物。试剂盒包括DEPC水、5×RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、Z溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品。本发明可同时针对黑腹果蝇10种自噬作用关键基因进行检测，一天内可完成192个样品的检测，既节约生产和检测成本，又提高检测效率；RNA内参提供样品RNA完整性的对照内参，确保检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性，使得检测具有更好灵敏度和特异性，从而避免其他检测方法特异性不高的问题。

技术领域

本发明涉及一种多重基因检测试剂盒及其应用，尤其是涉及一种黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。人们早就知道自噬作用的存在，但是只有在2016年度诺贝尔生理学与医学奖获奖者日本科学家大隅良典开拓性的研究之后，人们才意识到它的机制、懂得了它的重要性。目前，研究已经发现，自噬作用作为细胞中的清洁工，能够吞掉病原体，参与免疫反应；遭到扰乱的自噬过程与帕金森氏病、癌症、遗传病、2型糖尿病和老年人体内其他疾病都有所关联。深入了解和控制自噬作用，对于治疗疾病甚至延缓衰老进程，都具有重大意义。

黑腹果蝇是科学家们最为青睐的模式生物之一。黑腹果蝇具有生活史短，易饲养，繁殖快，染色体少，突变型多，个体小、易于观察等特点，被广泛用于遗传学的研究、发育中的基因调控的研究、各类神经疾病的研究、帕金森氏病、阿尔兹海默老年痴呆症、药物成瘾、酒精中毒、衰老与长寿、学习记忆、认知行为的研究等。在黑腹果蝇中，存在和人类基因保守一致的自噬作用基因，包括Atg3，Atg4，Atg5，Atg7，Atg8，Atg10，Atg12，Atg16。由于发达的遗传学研究已经让科学家能自由“改造”果蝇的基因和神经元，同时黑腹果蝇中自噬基因和人类基因的一致性，目前以黑腹果蝇为模型自噬作用相关的机制研究正在广泛的开展。

目前已有的检测黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平的方法包括实时荧光定量PCR,RNA测序、基因芯片、荧光原位杂交等技术。

(1)目前最常用的方法是实时荧光定量PCR。荧光定量PCR技术的优点：灵敏性高，并可精确定量，但也存在如下缺点：1)通量低：如果只用一种荧光标记，一次只能检测一个基因。当一个样品同时需要检测多种基因时，必须一个一个检测，成本相对增高，效率低，周期长，对大批量的样品更是无从下手。2)成本相对较高：如需要同时检测多个基因，就需要采用多种荧光标记；目前最多共同使用4到5种荧光标记，用于标记每个待检测基因片段，因此采用多种荧光标记成本相对较高。

(2)RNA测序作为一种较新的技术，具有灵敏性高、通量高的优点，但是成本昂贵。

(3)基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于芯片，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。具有高通量的优点，但是技术成本昂贵、复杂，探针的合成与固定比较复杂，不能精确定量，重复性差，灵敏度较低。

(4)荧光原位杂交方法是将荧光标记的基因探针原位杂交到细胞内核酸上，通过荧光显微镜来检测亮度定量基因表达水平，存在通量低、灵敏度较低、成本高的缺点。