[发明专利]黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物、试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物，其特征在于包括黑腹果蝇中自噬作用关键基因与RNA内参的RT PCR扩增引物和PCR扩增引物；其中RT PCR扩增引物为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21，PCR扩增引物为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22。

2.如权利要求1所述的黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的引物组合物，其特征在于黑腹果蝇中自噬作用关键基因包括Atg3，Atg4，Atg5，Atg7，Atg8，Atg10，Atg12，Atg16。

3.黑腹果蝇中自噬作用关键基因表达水平检测的试剂盒，其特征在于包括DEPC水、5×RT PCR缓冲液、反转录引物、反转录酶、Z溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品；

所述的反转录引物如权利要求1所述的RT PCR扩增引物；

所述的PCR引物如权利要求1所述的PCT扩增引物；

所述的Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸dNTPs和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列如SEQ ID NO.23，反向扩增引物序列如SEQ ID NO.24，其中通用引物正向扩增引物带荧光标记。

4.如权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤（1）、采集黑腹果蝇的组织样本，分离提取核酸；

步骤（2）、以核酸为模板进行RT PCR反应

取5-30ng/ul的核酸样品RNA5μL，DEPC水 8μL，5×RT PCR 缓冲液 4μL，RT PCR引物溶液 2μL，RT PCR酶 1μL 混匀后加入到 96 孔样品板上进行反转录，反应条件：48℃ 1分钟，42℃ 60分钟，95℃ 5分钟，4℃直至收取 RT PCR 产物，其中反转录引物溶液中各RT PCR引物浓度均为300nM，所述的RT PCR引物为如权利要求1所述的RT PCR扩增引物；

步骤（3）、以反转录产物为模板进行 PCR 反应

取RT PCR产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL， DNA聚合酶 1.4μL，Z溶液 2μL 混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃ 2分钟；94℃ 30秒钟，60℃30秒钟，70℃1分钟，循环35次；70℃1分钟；4℃直至收取PCR产物；其中所述的Z溶液包括三磷酸脱氧核苷酸dNTPs和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列如SEQ ID NO.23，反向扩增引物序列如SEQ ID NO.24，其中通用引物正向扩增引物带荧光标记；PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为250nM，PCR引物为如权利要求1所述的PCR扩增引物；

步骤（4）、GeXP 遗传分析仪毛细电泳分离样品

取PCR产物0.2-1μL，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75μL， DNA标准品 0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的实验组图谱与对照组图谱对比，判断基因表达的变化，并通过软件得到表达增加或者减少的百分比。